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耐热 DNA 聚合酶 Taq DNA酶 是一类耐热的DNA聚合酶。 具有5’-3’聚合酶活性和5’-3‘外切酶活性 多数Taq酶缺乏3’-5’外切酶活性， 反应温度～70 ℃ PCR（polymerse chain reaction,聚合酶链式反应) 逆转录酶（Reverse Transcriptase） 催化以RNA为模板的聚合反应，称依赖RNA的DNA聚合酶。 以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA，称为cDNA(complementary DNA)； RT-PCR 常见的逆转录酶: AMV:禽病毒来源 反应温度42 ℃ MMLV:鼠来源病毒 反应温度38 ℃ RT-PCR 末端转移酶（terminal transferase） 活性：催化dNTP加到3’羟基末端 用途：制造人工粘端 进行末端标记 碱性磷酸酶alkaline phosphatase 作用：去除5’磷酸基团，防止自身连接。 种类：BAP-细菌性碱性磷酸酶 CIP-牛小肠碱性磷酸酶 用途：基因克隆中防止载体自身环化 其它： 多聚核苷酸激酶：提供磷酸基团 RNase - ribonuclease DNase - deoxyribonuclaese 基因操作的载体 携带目的基因进入宿主细胞的运载工具（vector） 质粒载体 λ噬菌体(Lambda phage ) 克隆载体：目的基因的克隆、扩增序列分析等 表达载体（expression vector）：表达外源基因,带有启动子，核糖体结合位点以及表达标签等。 原核表达载体：E.coli 真核表达载体：酵母，哺乳动物，昆虫细胞表达载体 腺苷脱氨酶 (adenosine deaminase, ADA) Severe Combined Immunodeficiency, 重症联合免疫缺陷 载体的条件： 1 含有独立自主复制起点，便于在宿主中扩增； 2 一个或多个筛选标记，如抗性基因-氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr)；表型的显色反应等。 3 多克隆位点， 便于目的基因的克隆。 4 高拷贝，便于分离提纯。 筛选标记：用来区别重组质粒与非重组质粒。 当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。 筛选标记：当一个外源 DNA 片段克隆到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。用来区别重组质粒与非重组质粒。 α-互补： （α-complementation） 蓝白斑筛选 * 基因操作原理及相关技术 Part two: 基因操作(gene manipulation) 基因工程(gene engineering) 遗传工程 gene cloning molecular cloning 基因操作的核心部分为重组DNA技术。 Recombination DNA technology 基因工程与建筑工程 生物反应器 DNA Recombination 1 定义： 对目的基因进行体外重组，再将重组分子导入受体细胞，使这个基因在受体细胞中复制、转录、翻译表达的过程。 克隆（clone）：n,无性繁殖系及其后代。基因完全相同; v,指从同一祖先产生这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。 （Gene, cell,个体） 20世纪70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 理论上三大发现： Avery肺炎双球菌转化实验： 证实了遗传物质的本质是 DNA（1944年） Watson 和Crick： 提出DNA双螺旋结构模型（1953年） Nirenberg等： 确定了遗传信息的传递方向（1961-1966年） DNA RNA 蛋白质 技术上三大发明： 工具酶：分子手术刀，切割与缝合基因，包括限制性内切核酸酶、连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，对DNA或RNA进行各种各样的修饰。 载体(vector, vehicle)：本意是媒介体，在基因工程上指能将目的基因导入宿主细胞的DNA分子。 逆转录酶（reverse transcription,RT)：打破了中心法则，使真核基因制备成为可能，RT-PCR。 RNA DNA gene manipulation 过 程 1、目的基因的获取（PCR,gene library)； 2、载体(vector)的选择与构建(工具酶等）； 3、目的基因与载体连接，构建重组DNA分子； 4、重组DNA导入受体细胞，转化子筛选； 5、受体细胞中目的基