第6章 抗生素的生物合成.ppt

第六章 抗生素的生物合成及产生的遗传学 第一节 研究方法 完整地阐明生物合成过程应包括： (1)促成分子建成的初级代谢物结构单元的确立。 (2)代谢途径中中间产物的分离；这些产物的结构可能会提供关于反应次序问题的合理假设。 (3)催化每一个反应的酶的鉴定。 (4)操纵基因及其序列和组成的确定。 一、追踪技术 为确定相应的结构单元，将所设想的抗生素前体用14C，3H或13C等同位素标记，再将其加入到产生菌的培养物中，最好是在生长后期加入。 经过一段时间的培养后，提取其中相应的抗生素，纯化，检测所掺入的同位素。 在使用放射性同位素进行标记的过程中，常常需要对分子进行化学降解，以确定放射性同位素所掺入的组成该分子的原子。 13C标记前体 在利用13C标记前体时，掺入单个原子的情况可以通过产物的核磁共振(NMR)光谱来显示。 利用这项技术，分子中单个碳原子在共振光谱中以高峰出现，其高度与其中13C的含量几乎成正比。 标记物的渗入度可由所标记分子的峰值与天然产物的峰值之比来表示(13C的天然富足度为1.1％) 。 2-13C标记的乙酸掺入替考拉宁 (A)通过常规发酵得出的替考拉宁13C-NMR光谱(δ20-125 ppm带)； (B)通过[2-13C]标记的乙酸掺入发酵所得出的替考拉宁的光谱。可以看出，乙酸是二羟苯甘氨酸部分(小圆点)和脂肪酸链(大圆点)的前体物质。 2H标记前体物分子中两个相邻的原子 对核磁共振光谱峰及其偶合常数的多重性的高分辨分析，可以揭示出两个原子是否在整个代谢过程中都连结在一起，还是保持相对独立，或是通过不同的代谢途径掺入的。 通过利用氘标记的前体物的NMR的研究，同样可以获取重要的信息。与氢不同，氘在NMR中不会产生质子的共振信号。在生物合成反应机制的研究中，氘作为一种特殊的标记物质，在生物合成过程的反应位点上取代单个或多个氢原子。 在菌株培养过程中，这些中间产物则转变为终产物分子。终产物分子的质子NMR可以显示在酶促反应中，该原子是否被保留或被取代。 二、中间代谢物的鉴定 生物合成反应中某一步反应不能进行的突变株的分离，是用来鉴定合成途径中某些中间产物的一种普遍采用的适宜手段。这些被称为“阻断变株”的突变体，常导致培养基中那些无法参与下一步反应的底物的积累。 阻断变株可通过对产生菌进行诱变处理，然后分离出那些不具有产生抗生素能力的菌落而获得。 将这些变株一次两个在同一摇瓶内培养，发酵液进行抗菌活性的测定。 两种不同的突变株进行共培养 突变株单独培养时不能产生抗生素，但将两种不同的突变株进行共培养时，则可以产生抗生素，表明这两种突变株的突变发生在生物合成途径中的两个不同的阶段。 其中一种变株所不能合成的中间物，可由另一种能积累该中间物的变株所提供，从而使抗生素合成的一系列反应得以进行。 所积累的产物可以被分离和鉴定 为证实这些产物的确是生物合成途径的中间产物，可以通过原始出发菌株，由这些中间产物转变为终产物的实验以进行评价。 例如，我们可以将中间产物加入到产生菌的细胞悬浮物中，几小时后，测定其中抗生素的生成量，再与对照组中合成抗生素的量进行比较。 三、酶的鉴定 通过比较产抗生素株与不产抗生素变株中酶的活力，有时可以获取有关生物合成途径的一些信息。 产抗生素株中一种酶活力的存在，与阻断变株中该酶的缺失，即可有力地证明这种酶在该生物合成途径中起着重要的作用。 在示踪技术和中间物的分离技术为生物合成次序的确定提供足够信息的基础上，有可能从酶的角度来研究单个合成反应。 四、遗传学与重组DNA技术 在过去几年里，由于有关基因的克隆分析等一系列技术的应用，使次级代谢过程的生物合成和调节机制的研究取得了很大进展。 最初的研究发现，生物合成基因通常在染色体上成簇存在，在放线菌中尤其是这样。进一步研究又发现，在通常情况下，这些基因簇还包括调节基因和自身抗性基因。 确定生物合成基因两种不同策略 1．将某种抗生素产生菌(通常指放线菌)的其中一个基因文库转入到对该抗生素敏感的菌株中，筛选抗性克隆。从这些抗性克隆中分离出编码自身抗性的基因，然后可以着手分离侧翼的结构基因。 2．利用在相类似的生物合成途径中功能相似的基因通常具有的高度的同源性，可将相类似的生物合成途径的基因进行杂交。 生物合成基因确定后，将其核苷酸序列与数据库中已知的序列进行比较，可以揭示出基因产物的功能和特性，即其酶促作用和调节机能。而且，所推断的酶的氨基酸序列可能有助于我们了解生物合成反应的机制。 第二节 生物合成反应与途径 合成抗生素的酶促反应与生成初级代谢产物的中间代谢并非有根本的不同。 事实上，催化特殊代谢物合成的酶是由普通代谢中的酶进化而来。 抗生素生物合成的途径可分两大类 １．对初级代谢产物的修饰反应。 这类反应与初级代谢物的合成