NIYU 分子生物学 第九章 分子生物学技术.pptVIP

第十章 分子生物学技术 分子生物学的发展，已经产生了一整套分子生物学技术。几乎在一夜之间，这一技术已经成了研究许多基本生物学问题的重要手段。通过对DNA或RNA的提取，基因的分离，核苷酸序列的测定，人们将了解到基因及其所编码的蛋白质的结构，进而对其功能也有所认识。通过对基因的表达的研究，我们能了解基因的表达调节过程，进一步认识生命活动的规律。通过对基因进行突变和改造，我们将深入了解基因及其产物的结构和功能的关系。 一、分子克隆的概念 基因克隆（分子克隆molecular cloning）、重组DNA或基因工程都是指DNA的无性繁殖技术----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 基因克隆的核心-----体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 二、克隆载体 理想的载体应具备以下几个条件： 能够自我复制； 分子量要小，小分子DNA易处理，不易损伤，而且小分子质粒为多拷贝质粒，可用于基因扩增； 第二节 多聚酶链式反应技术 一、PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ① 模板DNA的变性 ② 模板DNA与引物的退火(复性) ③ 引物的延伸： 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的新链，而这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增几百万倍。 　 二、PCR反应条件与反应体系 ③ PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。 2、循环次数：决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 3、标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 　 10ul Mg2+　　　 1.5mmol/L 4种dNTP混合物 　 各200umol/L 引物 　　　　 　 各10～100pmol　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　 加双蒸水至 　 100ul PCR的反应动力学　 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用下式计算： Y＝(1＋X)n Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”。 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。 三、PCR扩增产物的分析 PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 1、凝胶电泳分析：PCR产物经电泳、EB染色后于紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致。 2、酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 3、分子杂交： 4、核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。 第三节 核酸的分子杂交 核酸分子杂交技术(hybridization) ，是在1968年由华