5.2细胞工程8.pptVIP

(1)机械法 叶片组织细胞排列松弛，分离单细胞的最好材料。 目前广泛应用的：叶片研碎→过滤→离心净化细胞 优点：不受酶的伤害，无需质壁分离。适于生理、生化等基础研究。 缺点：不能普遍适用；适于薄壁组织排列疏松细胞间接触点少。产量低不易获得大量活性细胞。 （2）酶解法 叶片组织分离单细胞的常用方法。 以烟草为例，酶解法如下： 取材（幼嫩完全展开叶）→表面消毒→无菌水冲洗→消毒的镊子撕下表皮→用解剖刀切成4cm×4cm的小块→置于酶液中→真空泵抽气→置于往复式摇床上2h，其间（每30分钟）更换酶液并检查单细胞游离情况→用培养基洗涤分离得到的单细胞后即可培养。 有些物种分离困难，如小麦、玉米等禾谷类植物。 看护培养 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： 细胞的驯化、筛选与细胞株的建立 愈伤组织的诱导与培养：将切取的材料放到培养基中，愈伤组织形成后进行继代培养 单细胞分离：选取生长疏松的愈伤组织转移到液体培养基中进行振荡培养。必要时加果胶酶使组织块分散成单个细胞 细胞无性系的分离：用不锈钢网滤除去细胞块，将细胞悬浮液浓缩接种于固体培养基培养 细胞株筛选：在平板培养皿地生长快速、疏松分散好的细胞株。再经过次生代谢物的定量测量，从中选出含量高的细胞株 扩大培养 采用逐级增加体积的容器将优良的细胞株经过多次扩大繁殖得到大量细胞，用作生物反应器培养的种子。 在放大过程中要经常鉴定细胞株，防止细胞株退化和变异 生物反应器培养 分批培养：一次添加培养液培养，期间不更换培养液 半连续培养：在培养过程中，每隔一定时间更换部分培养液或者添加某种营养成分 连续培养：连续地以一定速度添加培养液或营养盐，同时排出旧的培养液，总培养体积维持不变 3.4.6.4 植物细胞的大规模生物反应器培养 适合植物细胞培养的生物反应器的原则： 具有合适的氧传递、 良好的流动性 低的剪切力 生物反应器设计要考虑的几个因素： 结构严密，耐高压，耐腐蚀，表面光滑 有良好的气—液接触和液—固混和性能及热量交换性能 节省能源消耗 减少泡沫的产生 生物 反应器 机械搅拌式生物反应器 气动式生物反应器 鼓泡塔式生物反应器 气升式生物反应器 常用的生物反应器 （四）生物反应器技术 适用于不同培养对象的新型生物反应器的研制 提高生物反应器内部培养物生长的均匀性和空间利用率 培养物接种、取样、无菌化等操作技术的优化 不同培养体系生物反应器培养的动力学研究与工艺优化控制 生物反应器培养的放大技术 3.4 植物细胞培养 3.4.1定义 3.4.2植物细胞培养的方法 3.4.3植物细胞培养的培养基 3.4.4植物单细胞培养 3.4.5植物细胞培养的意义与应用举例 3.4.6植物细胞的生物反应器大规模培养 3.4.7植物细胞两相培养 3.4.8植物细胞的生物反应器固定化培养 3.4.9植物细胞培养存在的问题与发展趋势 植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 注意与植物组织培养的概念对比记忆 3.4.1定义 植物细胞培养的方法 植物细胞培养 固体培养 液体培养 琼脂培养 固定化培养 静置培养 悬浮培养 摇瓶悬浮培养 反应器培养 分批培养 半连续培养 连续培养 琼脂培养 振荡培养 悬浮培养的优点： 可以增加培养细胞与培养液的接触面，促进营养吸收 可以带走培养物的有害代谢产物，避免高浓度积聚对细胞的伤害 保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果 植物细胞培养的培养基 植物细胞能在简单的合成培养基上生长。其培养基主要由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复合物质组成。 无机盐类包括硝酸盐和铵盐，另培养基中必须加钾、磷、钙、硫等元素。 碳源主要指蔗糖与葡萄糖 植物生长激素指IAA、2，4-D、NAA、IBA、BA和玉米素 有机氮源指蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基酸混合物 有机酸指丙酮酸或者三羧酸循环中间产物 复合物质包括酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等 3.4.4 植物单细胞培养 单细胞制备的方法有机械法、酶解法、愈伤组织诱导法。 单细胞培养的方法有平板培养法、看护培养、微室培养法、纸桥培养法与饲层培养法、液体浅层静置培养法、细胞悬浮培养法 单细胞制备的方法有机械法、酶解法、愈伤组织诱导法。 平板培养法 将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养，称为平板培养 接种过程的实质：将一个琼脂或琼脂糖培养基与细胞悬浮液混合植板的过程，植板后的细胞被包埋在固体培养基中形成一个平板，因此称为平板培养。 优点：细胞固定在某一位置，可用于筛选特定的细胞及其无性系。 缺