秋MMCB实验5人基因组DNA的提取.pptVIP

MMCB实验 人基因组DNA的提取 赵 刚 医学生物学教研室 2010秋季版 实验目的 1、掌握人类与动物基因组DNA（gDNA）提取的基本方法。 2、了解gDNA提取过程中主要步骤的原理和试剂的功能。 实验原理 DNA提取是MB一项非常重要的基本技术； 制备纯净的gDNA是其它分生实验的基础； 真核细胞中，gDNA与蛋白结合成染色质； DNA的提取：设法破碎细胞、除去与DNA结合的蛋白以及细胞内的多糖、脂类和RNA分子等。 DNA提取常用SDS-蛋白酶K-酚抽提法。 DNA提取的原则与步骤 原则： 保证DNA一级结构完整，除去杂质。 主要步骤： 破碎细胞→除蛋白与多糖→ 分离DNA→除杂质（RNA、盐类）→ 鉴定 →储存 几种关键试剂的作用原理 SDS——离子型表面活性剂。能破坏质膜与核膜；解聚核蛋白；与蛋白结合使其变性而沉淀；抑制DNA酶活性。 蛋白酶K——广谱酶。将蛋白降解成小肽 。 酚、氯仿——使蛋白失水变性。在去蛋白方面，酚与氯仿各有利弊。 酚的变性作用大，但与水有点互溶，大约10％的水溶解在酚中，从而损失部分DNA。 gDNA提取所需主要试剂 蛋白酶K（proteinase K，PK） proteinase K，PK ——腐蚀 本实验使用浓度2.5mg/mL， 50μL 平衡酚、三氯甲烷（氯仿）—有毒！ 几种关键试剂的作用原理 氯仿——变性作用不如酚，但不与水相溶，不会带走DNA。所以在DNA提取时，与酚配合使用（有毒！小心）。 NaAc——中和DNA分子上的负电荷，消除DNA分子间的互斥力，易于相互聚合形成DNA钠盐沉淀。 无水乙醇——夺取DNA分子周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。 DNA提取所需试剂 实验材料 人胎儿 脐带组织 *乙醇保存 *男性 实验仪器——台式高速离心机 德国eppendrof公司 5415D型 德国Eppendorf -5415D型 高速离心机的使用 实验仪器——移液器（枪） 移液器（枪）——加样器的使用 实验仪器——恒温水浴箱 小离心管（eppendorf 管，ep管） 实验步骤 1、取材：切取1mm厚脐带组织，一分为四， 装入1.5mL ep管. 2、漂洗：用ddH2O将管中组织漂洗4次（上下振荡）每次1min-用水1mL，彻底去除乙醇. 3、剪碎：用眼科剪将组织块彻底剪碎. 4、加裂解液（STE液）500 μL，混匀. 5、加SDS液（10％） 50 μL ， 混匀. 6、加PK（2.5mg/mL）50 μL ，混匀. 7、消化：置65 ℃水浴中50min，其间颠混5次. 8．加等体积饱和酚（600μL）， 上下缓慢颠倒混匀5min. 9．离心：13000rpm，5min. 10．转移上清液（用剪口黄吸头） 至另一1.5 mL离心管中. 11. 加等体积酚-氯仿溶液 （酚氯仿 按1：1现配），缓慢颠倒混匀5min 。 12．离心：13000rpm，5min。 离心后的样品 离心后的分层现象 13．转移上清（剪口黄吸头）至另一ep管， 加入1/10体积的醋酸钠（NaAc）溶液，混匀。 14．加无水乙醇（冷冻、2倍体积），上下颠倒混合，可见DNA絮状沉淀析出。 15，吸弃乙醇，留下DNA沉淀 。 空气中晾干DNA（5-10min）。 17．加TE缓冲液30－50 μL （视DNA沉淀量多少）。冰箱中保存待检测。 DNA在乙醇中析出 DNA附在ep管壁 DNA附在ep管底 注意事项 操作时，要牢记DNA是线性大分子。 动作不能剧烈，否则会断裂，不完整。 枪头开口应剪大，以防机械剪切力 转移上清时，不要带入蛋白层。 苯酚有腐蚀性、氯仿有毒，小心使用。 分子生物学实验室常用的封口膜 实验报告 实验原理（包括主要试剂的作用） 实验操作（详细步骤） 结果与讨论（体会、注意事项） DNA提取实验剪影 七年制本科生的DNA提取实验 大家在等待高速离心的结果 THE END 核酸的凝胶电泳检测 原理：一定pH下，核酸带负电。故在直流电场中，核酸向正极泳动，泳动速度与核酸片断大小成反比。 常用电泳类型： 琼脂糖凝胶电泳 较大DNA片断（100bp—60kb）的鉴定和分离 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分辨率高。较小片断（5－500bp）鉴定和分离、DNA的测序 。 DNA片断的电泳分离 琼脂糖凝胶浓度 与DNA的分离范围 胶浓度（％） 线性DNA大小（k