基因工程研究应用.pptVIP

第二部分 基因克隆和DNA分析在研究中的应用 基因克隆的方法 研究基因、基因组的结构 研究基因的表达 PCR或RT-PCR法 从基因文库中分离基因 从cDNA文库中分离基因 人工合成法 转座子标签法 图位克隆法 差减杂交法、差异显示法 1 目的基因的直接选择 抗生素抗性基因可以直接选择 R6-5质粒上含四种抗性基因：kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物 将R6-5的片段插入pBR322的EcoRI位点中 kan可作为选择标记基因，只要能生长的克隆就含有kan抗性基因。 1目的基因的直接选择 利用突变系可扩展直接选择的范围 如要从E. coli中克隆trpA基因（编码色氨酸合成酶），利用E. coli的trpA营养缺陷型。 从正常E. coli细胞中提取总DNA，然后酶切，连接。 连接混合物转化缺陷型E. coli细胞，携带trpA的重组子可在基本培养基上生长。 1目的基因的直接选择 标记援救的范围和限制 必须存在着目的基因的突变品系 需要一种只有野生型能够生长的培养基。 一般而言，标记援救应用于生物合成酶，可以在基本培养上选择。 2 从基因文库中筛选目的克隆 基因文库：是某种特定的生物所含有的能够包含所有基因的足够数目的克隆的集合。一般是λ替换载体、粘粒或者是BAC、YAC或P1载体。 2 从基因文库中筛选、鉴定目的克隆 筛选方法 菌落（噬菌斑）原位杂交 标记探针方法 杂交信号显示方法 探针来源与鉴定方法 2.1 筛选方法 菌落原位杂交 将克隆或噬菌斑转移到纤维素膜或尼龙膜上，去掉残留物，只留下DNA。 80°C短时间处理，将DNA分子固定在膜上，尼龙膜需要进行紫外交联，通过糖-磷酸中枢将分子连接到膜上。 标记探针，加热变性，加入到杂交膜上进行杂交，然后洗去未结合的探针，干燥，结合探针的位置就可以检测出来。 标记探针的方法 缺刻平移 Nick translation 末端填充 end-filling 随机引物法 random priming 杂交信号的检测 放射性自显影 生物素标记法（抗生物素蛋白）。 将DNA与山葵过氧化酶连接，通过酶的活性降解发光氨产生化学荧光，直接在普通底片上显示出来。 2.2 鉴定目的克隆 利用mRNA的丰度 编码特定表达产物的基因的寡聚核苷酸探针 异质探针 免疫学筛选法 2.2.1 利用mRNA的丰度 2.2.1.1 cDNA文库构建 利用反转录酶，合成mRNA的互补链 RNase H降解杂交链中的RNA链 残留的RNA作为引物，利用DNA聚合酶I合成另外一条cDNA链，形成一个双链的DNA分子。 转化获得cDNA克隆。 2.2.1.2 筛选cDNA文库 随机选取一个克隆，纯化重组DNA分子 标记成探针，与剩余的克隆进行杂交 选取不同的克隆作探针，直到有一个探针能与文库中的大部分克隆杂交，这种丰富的cDNA可能就是gliadin基因，然后进一步分析验证。 2.2.2 寡聚核苷酸探针 利用遗传密码子预测相关基因的核苷酸序列 只有蛋氨酸和色氨酸无兼并密码。例如丙氨酸有四种密码子，GCA,GCT,GCC,GCG，只能正确的预测两位的碱基。 2.2.3 异质探针 不同生物控制同一蛋白的基因，有许多相同的序列，显示了进化中的保守性。 多基因家族中基因鉴定同一生物中相关的基因。例如gliadin丰度探针如果用来筛选基因文库，可以鉴定出其他的一些基因。 2.2.4 免疫学筛选 抗体 10ml的兔血 Western blotting 聚乙烯膜 思考题 直接选择法的应用范围 基因文库、cDNA文库、菌落原位 杂交 标记探针的方法 杂交信号的检测方法 从基因文库中筛选目的克隆时可 使用的探针类型 Examples of the practical use hybridization probing If the gene itself is not available, what can be used as the probe? (a) Abundancy probing to analysis a cDNA library (b) Oligonucleotide probes for genes whose translation products have been characterized p176 The amino acid sequence of yeast cytochrome c. TGG-GA(T/C)-GA(A/G)-AA(T/C)-AA(T/C)-ATG Oligonucleotide synthesis DMT, 二甲氧三苯甲基（在DNA合成中用作羟基保护剂） 二甲稀丙基焦磷酸 Use a end-lab