酶联免疫吸附测定法82.ppt

* 酶联免疫吸附测定法 生物体系中的化学测量 裴丹 复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病诊断和预防的过程中也日益凸现其重要作用。 经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力。 于是，一系列针对生物体系中化学成分的测量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。 什么是 酶联免疫分析技术 ELISA的基本原理和方法 ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。 一、基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂） 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后， 再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。 其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。 其方法简单，方便讯速，特异性强。 二、酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应. 酶 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖苷酶 底 物 邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 显色反应 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色 黄色红色 黄色深蓝色 荧光黄色 测定波长 492 460 449425642 400500 405 420 360,450420 ELISA的种类和变化 （一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA （一）双抗体夹心法 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 获得待分析物的未标定抗体 将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点 洗涤并除去未结合的封闭蛋白 加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质 加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体 加底物进行 酶催化反应 根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定 　　 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。 （二）间接法 包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体 加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体 加底物 显色 根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定 （三）竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。 用已知特异性 抗体包被 固相载体 测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原