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关于β 射线诱导人肝癌细胞凋亡 【关键词】188，Re 关键词:188 Re;凋亡;β 射线;肝癌细胞 0 引言 凋亡或细胞程序性死亡是一种不同于细胞坏死的死亡方式，是在基因控制 下的有序死亡，是一个主动性自杀过程，常伴有特征性形态学和生化变化.临床 上放射线治疗肿瘤主要应用射线诱导细胞凋亡这一机制.188 Re 发射2110KeV 的β 射线，155KeVγ 射线，半衰期17h，具有良好的核物理性质.国外188 Re 的研究主要在188 Re 标记单克隆抗体对肿瘤的放射免疫治疗，并显示具有一定 的疗效，而国内关于188 Re 的研究较少，经文献检索未见有关于188 Re 诱导 细胞凋亡的报道.本实验旨在研究188 Re-β 射线诱导人肝癌细胞系hHCC （human hepatoma carcinoma cell，人原发性肝癌细胞）凋亡的形态学变化、 细胞周期，以探讨其发生机制. 1 材料和方法 1.1 材料 吖啶噔染料（AO 染料），美国Amersco 公司.188 Re 可由188 W-188 Re 发生器淋洗得到，188W-188 Re 发生器购自上海科兴药业公司.日本 Olympus BX60 荧光显微镜.美国库尔特公司ELITE ESP 型流式细胞仪.日本JEM- 2000EX 电子显微镜. 1.2 方法 1.2.1 细胞培养方法 hHCC （中科院上海细胞所细胞库）培养于含100mL ・ L-1 小牛血清的RPMI1640 培养瓶中，培育箱37℃，含50mL ・L-1 CO2 . 1.2.2 吖啶噔染色标本的制备 10mg 吖啶噔加入100mL PBS，溶解、过滤、 4℃避光保存.用6 孔板接种hHCC，每孔1×105 ;在另一板上设阴性对照，即只 加细胞不加放射性核素188 Re，分箱培养.以7.4，11.1，14.8，18.5 和 22.2MBq188 Re 分别加入hHCC 培养孔中，培养72h，将细胞消化吹下，制备成 细胞悬液，取95μ L 细胞悬液，加入5μ L 吖啶噔储存液，混匀，吸一滴混合液 滴在载玻片上，加上盖玻片，荧光显微镜下观察、照相. 1.2.3 透射电镜标本的制作 hHCC1×105 接种于培养瓶中，培养24h，换 液，加入188 Re11.1MBq，继续培养72h.弃培养液，将细胞消化下来，以 1000r ・min-1 离心8min，弃上清，加入30mL ・L-1 戊二醛固定，然后加入 10mg ・L-1 锇酸固定，再经程序脱水、渗透、环氧树脂包埋、超薄切片、铅铀 染色，透射电镜下观察. 1.2.4 流式细胞仪标本的制作 hHCC 以1×105 接种于培养瓶中，培养 24h， 换培养液，分别加入3.7，7.4，11.1，14.8，18.5 和22.2MBq188 Re，培养 72h，另设阴性对照细胞，分箱培养.将细胞消化下来，PBS 洗2 遍，调整成1× 109 ・L-1 单细胞悬液，取1mL 细胞再加2mL4℃无水乙醇，吹散混匀，封口膜 4℃保存24h 以上.上流式细胞仪前，用PBS 再洗一次，加碘化丙锭染色，测定 DNA 含量变化，分析细胞凋亡和细胞周期情况. 2 结果 2.1 荧光显微镜形态观察 hHCC 经不同剂量 188 Re 照射后，细胞出现凋亡、 死亡现象.正常细胞的细胞核DNA 呈黄绿色均匀荧光，细胞质为橘黄色荧光，凋 亡细胞的胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光，甚至有黄绿色凋亡小体， 坏死细胞的细胞质内黄绿色荧光均减弱甚至消失.阴性对照的细胞核形态完整、 清晰，呈均匀的黄绿色荧光，胞核中有空泡，细胞质为橘黄色，形态完 整.7.4MBq 剂量细胞大致完整，胞核清楚，胞膜清晰无破裂，坏死细胞少见， 细胞内荧光基本如对照组，染色均匀，凋亡细胞少见，11.1，14.8MBq 剂量组 黄绿色深染的凋亡细胞较多，如图1 示其胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿 色荧光颗粒，甚至可见整个细胞固缩，明显的黄绿色致密浓染的荧光，分不清 胞核与胞质，另见与胞体脱离的黄绿色浓染的数个凋亡小体呈圆形，细胞膜有 伪足样突起.18.5，22.2MBq 细胞大多死亡，死亡细胞黄绿色荧光减弱，染色浅 淡，坏死细胞大多破裂，胞质流失，细胞形态不规则（图2）. 2.2 电镜观察 凋亡肝癌细胞微绒毛脱失，染色质固缩并凝结成块边集，细 胞浆浓缩，内质网疏松与胞膜融合，形成一个个空泡.线粒体缩小，结构无明显 变化（图3）. 图1