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分子生物学实验简明手册 佛山科学技术学院生命科学学院 2003年三月 实验一 小规模制备质粒DNA(碱变性法) 目的 学习掌握碱变性法提取质粒DNA的原理和技术，同时学会质粒DNA提纯的方法，熟悉基因工程载体的特性。获得的质粒DNA可用于限制性内切酶鉴定、PCR分析等。 原理 碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而将其分离。碱性(pH高达12.6)条件下DNA分子氢键断裂，双螺旋结构被破坏而变性，用pH4.8的Kac缓冲液中和溶液至中性时，质粒DNA分子小较快复性恢复原来构型，而染色体DNA则不能恢复缠绕的超螺旋构型与细胞碎片一起可以通过离心去除，质粒DNA溶液可进一步纯化。 材料 菌种：大肠杆菌K12菌株－XL1-Blue: supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 thi relA1 lac- F’[proAB+ lacIq lacZ⊿M15 Tn10(tetr)], 为重组缺陷菌株。 质粒DNA：pUC19, 2.68kb, 克隆载体含氨苄青霉素抗性基因及半乳糖苷酶基因的Z基因即lacZ基因，lacZ基因含多克隆位点（多个单一限制性酶切点）用于克隆外源基因。质粒已转化入XL1-Blue菌株。pUC序列质粒属高拷贝质粒，每ml菌液一般可提取3～5(g质粒DNA。 仪器：超净工作台、恒温水浴、恒温摇床、高速离心机、酸度计、称量天平、微量进样器、高压灭菌锅、电泳仪、电泳槽、核酸蛋白质影像系统。 器皿：培养皿、塑料离心管、试剂瓶、移液器吸头、烧杯、量筒、酒精灯。 培养基：LB培养基－蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母浸出液5g，加水800ml，溶解后调节pH至7.0, 定容1000ml，分装于三角瓶，固体培养基加1.5%琼脂粉，15磅/吋2灭菌20分钟。 试剂： 氨苄青霉素（Amp）－100mg/ml，用灭菌水配制。 溶液I：50mmol/L 葡萄糖 10 mmol/L EDTA [用母液0.5mol/L EDTA(pH8.0)配制] 25 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) [用母液1.0mol/L Tris (pH8.0)配制] 溶液II：200mmol/L NaOH [用10mol/L NaOH配制] 1% SDS [用10% SDS配制] 溶液III：KAc 3.0mol/L [配制100ml：5mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml，水28.5ml] 25 mmol/L Tris (pH8.0), 30mmol/LEDTA溶液： [用母液1.0mol/L Tris (pH8.0)，0.5mol/L EDTA(pH8.0)配制] TE溶液：10mmol/L Tris (pH8.0), 1mmol/L EDTA(pH8.0) 氯仿/异戊醇(24/1)，异丙醇，75%乙醇 RNaseI(10mg/ml) TAE电泳缓冲液：40mmol/L Tris-乙酸，1mmol/L EDTA(pH8.0) 琼脂糖(国产) 溴酚蓝加样缓冲液(6x)：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖溶液 溴化乙锭溶液(0.5(g/ml) 方法步骤 细菌培养： 超静工作台上挑取pUC19平板单菌落于加Amp(100(g /ml) 3ml LB液体培养基 37℃ 振荡培养过夜(16小时) 菌体收集： 3ml菌液倒于1.5ml Eppendorf离心管，5Krpm离心30秒，弃去上清 溶液I： 加冰浴预冷的溶液I 100(l，旋涡混和器上振荡1min，冰上5min 溶液II： 加入溶液II 200(l，倒置几次混匀，室温2min 溶液III： 加入预冷的溶液III 150(l, 倒置混匀，冰浴5min 沉淀细胞碎片、染色体DNA： 10Krpm离心3min，上清吸出于新管 氯仿:异戊醇抽提：加等体积氯仿:异戊醇，剧烈振荡1min，离心10Krpm离心3min 异丙醇沉淀：上清置于新管，加1/10体积3mol NaAc溶液，加入等体积异丙醇，室温5min 沉淀质粒DNA：10Krpm离心5min，去上清，沉淀用75%洗一下，超静工作台吹干 TE溶解DNA：加40(l TE溶解沉淀，加1(lRNaseI，手指轻弹管底，离心5秒，4℃保存 电泳检测：取2(l DNA溶液进行电泳（0.8%琼脂糖），100V 30min，取出凝胶溴化乙锭15min 拍照：用UVP核酸蛋白影像系统UV下进行凝胶DNA电泳图谱进行拍摄，计算DNA含量 实验报告 1. 记录实验操作过程及实验结果 2. 分析实验数据 六、参考文献 彭秀玲