asshgrp78增强腺苷与同型半胱氨酸抗肝癌hepg2细胞作用的研究word格式论文.docx

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asshgrp78增强腺苷与同型半胱氨酸抗肝癌hepg2细胞作用的研究word格式论文

学位论文知识产权声明本人在就读研究生期间所完成的学位论文以及相关结果,知识产权归属 汕头大学医学院。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交导 师,离校后发表或使用学位论文或与学位论文直接相关的学术论文或成果时, 须征得导师及导师所在单位的同意,并要求署名单位仍为汕头大学医学院。 本人不得以本论文的研究成果申报研究课题。导师和导师单位可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段进行保存、汇编学位论文,可以公布(包括刊登)论文的全部或 部分内容。导师及导师所在单位享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。注:保密的学位论文在解密后适用本声明。研究生签名:日期:年月日导师签名:日期:年月日汕头大学医学院硕士学位论文中文摘要目的:1. 使用 RNAi 技术下调 GRP78 表达,联合使用腺苷(Ado)与同型半胱氨酸(Hcy),检测 对 HepG2 细胞的毒性作用、凋亡相关机制及表观遗传学改变。2.采用 GatewayTM 克隆技术构建人长链非编码 RNA MEG3 过表达的重组慢病毒载体。方法:1. 通过前期构建的 Ad-shGRP78 转染 HepG2 细胞下调 GRP78 的表达,联合使用 Ado 与 Hcy, MTT 检测细胞增殖;DAPI 核染检测凋亡;FCM/PI 染色检测细胞周期;Western blot 检 测蛋白表达水平。2. RT-PCR 检测 MEG3 表达、MSP 检测 MEG3 启动子甲基化;3. 构建 MEG3 基因真核表达载体 pcDNA3.1-MEG3;4. 采用 GatewayTM 克隆技术表达载体,转入 293FT 细胞进行慢病毒包装并完成滴度测定。5. 重组慢病毒 MEG3 转染 HepG2 细胞,RT-PCR 评价过表达效果。结果1、 MTT 结果表明:下调 GRP78 可增强 Ado 与 Hcy 诱导 HepG2 细胞的增殖抑制。2、 DAPI 结果表明:下调 GRP78 可增强 Ado 与 Hcy 诱导的 HepG2 细胞凋亡。3、 FCM/PI 结果表明:下调 GRP78 可增强 Ado 与 Hcy 诱导 HepG2 细胞周期阻滞。4、 Western blot 结果表明:Ado 与 Hcy 可以通过内质网应激与线粒体途径诱导细胞凋亡, 下调 GRP78 可以增强凋亡作用。Ado 与 Hcy 可通过 p53 来阻滞细胞周期。5、 Ado 与 Hcy 联合作用可改变 MEG3 启动子甲基化水平,活化 MEG3 基因。6、成功构建真核表达载体 pcDNA3.1-MEG3,在 293FT 细胞中包装重组慢病毒 Lv-MEG3;成 功在 HepG2 细胞中过表达 MEG3。结论:1. 分子伴侣 GRP78 在应激状态下具有保护细胞生存的作用。下调 GRP78 可明显增强 Ado 与 Hcy 对 HepG2 细胞的毒性效应,包括诱导细胞增殖抑制、通过内质网应激途径与线粒体 途径诱导 HepG2 细胞凋亡。下调 GRP78 可以增强 Ado 与 Hcy 诱导细胞凋亡的作用,涉及活I汕头大学医学院硕士学位论文化 caspase-4、CHOP 等 ERS 相关通路因子及细胞色素 C,caspase-9、caspase-3 等线粒体途径相关蛋白。Ado 与 Hcy 联合作用可阻滞细胞于 G0/G1 期,涉及 P53、MDM-2、CyclinD1 等细胞周期相关因子。同时下调 GRP78 可以增强细胞周期阻滞的作用。2. Ado 与 Hcy 联合用药可降低 MEG3 启动子甲基化水平。MEG3 表达增加可抑制肿瘤细胞增 殖。3. 采用 GatewayTM 技术成功构建人 MEG3 慢病毒过表达载体,对 HepG2 细胞有效地进行 MEG3 基因过表达。关键词:葡萄糖调节蛋白 78;腺苷;同型半胱氨酸;GatewayTM 克隆技术;长链非编码 RNA 母系表达基因;II汕头大学医学院硕士学位论文英文摘要Objective:To evaluate the cytooxity induced by adenosine (Ado) and Homocysteine (Hcy) in HepG2 cells, by combination with transfection of Ad-shGRP78.To construct human recombinant lentiviral vector of long noncoding RNA maternally expressed gene 3 (MEG3) by GatewayTM cloning technology.Methods:1. The adenovirus vector-deli

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