brdu标记示踪脂肪成体干细胞成骨分化的实验分析word格式论文.docxVIP

缩略语表缩略词ADASCs ALP BMSCsBrdU CPCDAB英文全称adipose-derived adult stem cells alkaline phosphatase bone marrow stromal cells bromodeoxyuridine calcium phosphate cement diaminobenzidine中文全称脂肪成体干细胞 碱性磷酸酶 骨髓基质干细胞5-溴脱氧尿嘧啶核苷 磷酸钙骨水泥3,3-二氨联苯胺DMEMDulbecco,s modified eagle mediumDMEM 培养基DMSOdimethyl sulfoxide二甲基亚砜EGFPenhanced green fluorescentprotein,增强型绿色荧光蛋白ESCsembryonic stem cells胚胎干细胞GFPgreen fluorescent protein绿色荧光蛋白HAhydroxyapatite羟基磷灰石MTTmethyl thiazolyl tetrazolium四甲基偶氮唑蓝NCnatural coral天然珊瑚PBSphosphate buffer saline磷酸盐缓冲液PGApolyglycollc acid聚羟基乙酸PLA RCBRpm SABCpolylactic acid rabbit cancellous bone revolutions per minute strept avidin-biotin complex聚乳酸兔松质骨载体 每分钟转速链霉亲和素－生物素－过氧化物酶复合物SEM TCPTGF-βscanning electron microscope tricalcium phosphatetransforming growth factor-β扫描电镜 磷酸三钙转化生长因子βBrdU 标记示踪脂肪成体干细胞成骨分化的实验研究硕士研究 生：李建伟导师：胡蕴玉 教授 第四军医大学西京医院骨科，西安 710032中文摘要因创伤、肿瘤切除、感染等原因引起的骨缺损和骨不连是骨科临床上常 见的问题，也是治疗上比较棘手的问题。近些年来，随着组织工程技术的迅 速兴起与发展，试图通过骨组织工程来解决上述问题已逐渐成为研究的热点。 骨组织工程技术主要包括种子细胞、支架材料、细胞因子等要素。其中种子 细胞的来源是骨组织工程中首先需要解决的问题，并且是保证骨组织工程能 够进一步深入发展的前提。获取一种功能良好、来源充足的理想种子细胞已 成为目前骨组织工程研究和发展的迫切任务之一。在本课题中，我们选择了 一种新型来源的种子干细胞—脂肪成体干细胞。通过用 BrdU 标记脂肪成体 干细胞，体外成骨诱导，然后植入体内，示踪其在体内的分化行为，从而探 讨脂肪成体干细胞作为种子细胞在骨组织工程中广泛应用的可行性。目的：从兔脂肪组织中分离出脂肪成体干细胞（ADASCs），体外进行原代及 传代培养后，用 BrdU 进行标记，观察 BrdU 对 ADASCs 生长增殖状况的影响， 探索 BrdU 用于标记脂肪成体干细胞的可行性。如果可行，那用 BrdU 标记ADASCs，体外成骨方向诱导后，植入体内，示踪 ADASCs 在体内的分化行为，从而探讨 ADASCs 作为种子细胞在骨组织工程中广泛应用的可行性。 方法：BrdU 体外标记 ADASCs从成年新西兰大白兔颈背部成功获取脂肪组织，剥离剪碎后用Ⅰ型胶原 酶消化，得到 ADASCs。分离培养 ADASCs,第三代 ADASCs 融合约 50%时, 加入终浓度 25μmol/L 的 BrdU 孵育 48h,BrdU 免疫组化染色，检测标记情况。 然后通过显微镜下形态学观察、台盼蓝排斥试验、MTT 试验，观测 BrdU 对 ADASCs 生长增殖状况的影响。2. BrdU 标记示踪脂肪成体干细胞体内成骨分化在确定 BrdU 可以用于标记 ADASCs 的基础上，将 BrdU 标记过的 ADASCs 体外向成骨方向诱导分化培养，通过碱性磷酸酶 Gomori 改良钙钴法 染色、茜素红钙结节染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色鉴定 ADASCs 成骨分化情 况。然后将 BrdU 标记后诱导分化培养 2 周的 ADASCs 与兔松质骨载体(rabbit cancellous bone,RCB)复合, 并通过扫描电镜观察 ADASCs 在 RCB 上的生长 情况，在成骨诱导培养基中共培养 7 天后，植入 ADASCs 所属的自体兔肌袋 内。分别于 4 周、8 周、12 周后取材,切片 HE 染色观察新骨生成情况；切片 BrdU 免疫组化染色观察 ADASCs 在体内的分化及成骨情况，探讨 ADASCs 作为种子细胞在骨组织工程中广泛应用是否可行。结果：1.BrdU