b群脑膜炎奈瑟菌nspa核酸疫苗的免疫活性及保护作用的初步分析word格式论文.docx

roswell park memorial instituteRPMI-1640 培养基RPMImediumB群脑膜炎奈瑟菌NspA核酸疫苗的免疫活性及保护作用的初步研究硕士研究生：邓苏宏导师：胡四海教授中文摘要目的：扩增B群脑膜炎奈瑟菌表面蛋白A（NspA）基因，构建pcDNA3.1(+)/NspA 真核重组载体，通过肌注和滴鼻法免疫雌性BALB/c 小鼠，观察小鼠体内产生体液免疫和细胞免疫应答水平，计算疫苗的免疫保护率，为研究B群脑膜炎奈瑟菌核酸疫苗提供相关的实验依据。方法：制备去内毒素的pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体，通过Lip2000 转染试剂在RAW264.7 和COS-7 细胞中进行转染，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测nspa基因mRNA的转录水平，通过免疫组化法检测NspA基因在真核细胞中的表达水平。通过肌注和滴鼻的方式免疫3-4 周龄的雌性BALB/c 小鼠，采用间接ELISA 法检测小鼠血清中产生的特异性IgG和生殖道黏膜灌洗液中sIgA抗体水平，ELISA 双抗体夹心法检测免疫小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ、IL-4 的水平，CCK8 法检测脾淋巴细胞增殖反应。构建脑膜炎球菌动物感染模型，观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护率。结果：（1）构建的pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体经公司测序及酶切鉴定结果正确。（2）pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体能有效地在真核细胞中进行转录和表达。(3) 核酸疫苗通过滴鼻和肌注法免疫小鼠后，能够刺激小鼠体内产生特异性抗NspA的抗体，并且抗体水平随免疫时间递增呈上升趋势：①在免疫后第6 周，滴鼻法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG 组的小鼠生殖道灌洗液中特异性sIgA水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.01），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG 与pcDNA3.1(+)/NspA相比较无显著性差异（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG 组抗体效价为1:3000；肌注法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG 组的小鼠生殖道灌洗液中特异性sIgA水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.01），而pcDNA3.1(+)/NspA+CpG与pcDNA3.1(+)/NspA相比较无显著性差异（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG 组抗体效价为1:1875；②在免疫后第6周，滴鼻法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的小鼠血清中特异性IgG水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.01），而pcDNA3.1(+)/NspA+CpG 与pcDNA3.1(+)/NspA相比较无显著性差异（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG 组抗体效价为1:3750；肌注法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG 组的小鼠血清中特异性IgG水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.01 ），而pcDNA3.1(+)/NspA+CpG与pcDNA3.1(+)/NspA相比较无显著性差异（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG 组抗体效价为1:5000；③经滴鼻和肌注免疫的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组小鼠脾淋巴细胞上清液中的IL-4、IFN-γ含量明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.01），而pcDNA3.1(+)/NspA+CpG 与pcDNA3.1(+)/NspA相比较无显著性差异（P0.05）；④肌注法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的脾淋巴细胞刺激指数（SI，1.45±0.03）显著高于、PBS（0.30±0.01）与pcDNA3.1（+）组（0.44±0.02），（P0.05）；滴鼻法pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的S（I±0.06）明显高于PBS（0.34±0.05）与pcDNA3.1（+）组（0.51±0.04），（P0.05）；而肌注法、滴鼻法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG与pcDNA3.1(+)/NspA组相比较无显著性差异（P0.05）；(4) 核酸疫苗的免疫保护效果：①肌注法：pcDNA3.1(+)/NspA +CpG、pcDNA3.1(+)/NspA组在72h内的存活率分别为90%、80%；pcDNA3.1(+)组和PBS 组24h 内的存活率分别为30%和20%，48h 内的存活率均为0；②滴鼻法：pcDNA3.1(+)/NspA+CpG、pcDNA3.1(+)/NspA组在72h内的存活率分别为80%、70%，pcDNA3.1(+)组和PBS组24h 内的存活率分别为30%和20%，48h 内的存活率均为0。