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cry4b基因的克隆 表达及其在蕈蚊中受体的初步分析word格式论文
独创性声明本人声明,所呈交的学位(毕业)论文,是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果,并且是自己撰写的。尽我所知,除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,如被查有侵犯他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名:日期:论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定,即学校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密,在年后解密可适用本授权书。□ 不保密,本论文属于不保密。□学位(毕业)论文作者亲笔签名:日期:指导教师亲笔签名:日期:目录摘要IAbstractII引言 11 眼蕈蚊生物学习性及危害12 眼蕈蚊防治现状22.1 农业防治22.2物理防治22.3 化学防治32.4 生物防治33 眼蕈蚊的饲养44 Bt 杀蚊研究概况44.1Bt的研究概况44.2ICPs 分类及杀虫机理44.2.1Cry和Cyt对蚊虫的作用机制54.2.2研究受体的技术手段65 本研究的目的和意义71 厉眼蕈蚊的简易饲养及环境对蕈蚊生长发育的影响 81.1 材料 81.1.1 供试虫源81.1.2 饲料81.1.3 养虫笼81.1.4 养虫盒81.1.5 成虫收集81.1.6 虫卵收集81.2 温度和湿度梯度设置82 LLP29cry4B基因的克隆和表达92.1 材料 92.1.1 蕈蚊与供试菌株92.1.2 试剂与耗材92.2试验方法9Bt总DNA 的提取9cry4B基因的克隆 引物设计 Pfu高保真酶PCR扩增琼脂糖凝胶上DNA片段的回收 PCR扩增产物添加A尾大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 cry4B基因的克隆重组质粒的酶切验证 测序cry4B基因的生物信息学分析142.2.3cry4B 基因的原核表达 质粒的双酶切重组表达载体的构建 重组质粒的酶切验证 蛋白表达和纯化163.1 材料 193.1.1 蕈蚊193.1.2 试剂与耗材193.1.3 主要缓冲液193.2 蕈蚊中肠刷状缘膜蛋白(BBMV)的提取193.3BBMV结合蛋白的分离与鉴定203.3.1Cry4B蛋白的生物素标记203.3.2葡聚糖凝胶色谱分离活性蛋白片段葡聚糖凝胶的试验前处理 装柱与平衡样品的添加与洗脱203.4结合蛋白的Pulls down试验203.5 蛋白质的质谱检测214 结果与分析 224.1 眼蕈蚊的最佳饲养条件224.2cry4B 基因的克隆244.3 生物信息学分析254.3.1 序列同源性分析254.3.2cry4B 基因的基本理化性质274.3.3cry4B 基因编码蛋白的结构预测284.3.4cry4B 基因的系统发育分析294.4cry4B 的原核表达304.4.1 表达载体的构建304.4.2IPTG 诱导Cry4B的表达314.5 生物测定324.6结合蛋白的Pulls down 分离试验334.7 质谱检测34小结与讨论 35参考文献 37致谢 41摘要厉眼蕈蚊(Lycoriellasp.)是危害食用菌的一种双翅目害虫,它以幼虫取食食用菌,对食用菌产量造成严重的影响。本研究采用山药作为眼蕈蚊的饲料,通过控制温度和湿度的变化,选出最佳饲养条件,即在湿度为80%,温度25°C的条件下,幼虫的存活率和存活历期均最长,短期内建立种群,在试验室进行蕈蚊的大量饲养。苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)LLP29是一株高效杀蚊菌株。经前期试验,发现浓度较高的LLP29菌株发酵液能较好地控制眼蕈蚊的幼虫。Bt LLP29 菌株Cry4B具有较高的杀虫毒性。本研究根据cry4B基因序列设计的特异性引物,成功克隆了LLP29特有的cry4B 基因,并对其进行了生物信息学分析,发现cry4B 基因和已报道的cry4B 之间的同源性高达99%,同时还揭示出了cry4B 基因及其编码蛋白的一些生物和理化性质,表明该蛋白不含信号肽,无跨膜区域。通过氨基酸分值高低,得出该蛋白为亲水性蛋白。结构域预测表明Cry4B由Endotoxin_N、Endoto
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