dj1促胃癌细胞侵袭迁移及其机制的研究word格式论文.docx

中文摘要胃癌是我国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，侵袭和转移是导致死亡 的主要因素，也是影响胃癌临床整体治疗水平的关键因素。因此深入探讨胃癌 侵袭和转移机制，寻找胃癌侵袭转移相关的蛋白分子，对胃癌的治疗及预后具 有重要的意义。DJ-l 蛋白是 1997 年首次报道的一种丝裂原依赖性癌基因产物，该蛋白高度 保守、广泛表达于机体各组织细胞，并以同源二聚体的形式参与细胞多种病理 生理活动，如基因转录的调控、抗氧化应激、抗细胞凋亡、“分子伴侣”及促细胞 生长增殖等。近年来，随着研究的深入，越来越多的研究表明 DJ-1 与肿瘤密切 相关，在许多肿瘤的发展、侵袭、转移中可能起重要作用，但 DJ-1 在胃癌侵袭 转移中的作用未见报道。众所周知，胃癌侵袭转移是一个多步骤、多基因参与的复杂序贯过程。其 中，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-2 和 MMP-9 所介导的细胞 基底膜及外基质降解破坏至关重要，被认为是胃癌侵袭和转移的必要步骤。目 前研究已证实，胃癌侵袭转移中 MMP-2 与 MMP-9 蛋白表达的调控涉及 Akt 信 号通路。然而，值得关注的是，最近研究表明 DJ-1 可能是 Akt 信号通路的一个 重要的正性调控蛋白。据此，我们假设：DJ-1 可能参与胃癌的侵袭转移，其机 制可能通过激活 Akt 信号通路，进而上调 MMP-2、MMP-9 的表达，促进胃癌 细胞侵袭转移。为此，本研究拟从细胞水平，应用基因转染及 RNA 干扰等分子生物学手段， 通过体外侵袭和迁移实验模型，观察 DJ-1 不同表达水平对胃癌细胞侵袭迁移能 力的影响，以求阐明 DJ-1 是否参与胃癌侵袭转移；同时，从 Akt 信号通路及细 胞内 MMP-2、MMP-9 表达改变的角度进一步探讨 DJ-1 促胃癌细胞侵袭迁移的 分子机制。该研究将为在整体水平上进一步探讨 DJ-1 在胃癌腹膜转移中的作用 提供线索，同时也为胃癌侵袭转移的防治提供新思路和新的干预环节。II第一部分DJ-1 不同表达水平对胃癌细胞侵袭迁移的影响目的：应用基因转染及 RNA 干扰等分子生物学手段，通过体外侵袭和迁移实验模 型，观察 DJ-1 不同表达水平对胃癌细胞侵袭迁移能力的影响，在细胞水平以求 阐明 DJ-1 是否参与胃癌细胞侵袭转移。方法：1. 设计 3 条靶向人源 DJ-1 基因的候选 RNA 干扰序列，并利用 shRNA 真核 表达载体 pGPU6/GFP/Neo 构建重组质粒；同时设计并构建阴性对照 RNA 干扰 重组载体，用于鉴定 pGPU6/GFP/Neo 质粒介导的 RNA 干扰体系的特异性；2. 经 DNA 测序确认后，将构建成功的各重组 shRNA 表达载体利用脂质体 瞬时转染 SGC7901 胃癌细胞，转染 24 h 后，RT-PCR 和 Western Blot 检测 DJ-1 mRNA 和蛋白表达情况，并筛选出最佳抑制效率的重组 shRNA 表达质粒；3. 将筛选出的抑制 DJ-1 表达最有效的重组 shRNA 表达载体稳定转染 SGC7901 胃癌细胞，同时稳定转染阴性对照的干扰质粒作为对照，经新霉素抗 性筛选、加压培养建系后，RT-PCR 及 Western blot 检测所筛选细胞中 DJ-1 mRNA 和蛋白的表达；4. 经 Blast 验证，大鼠 DJ-1 mRNA 序列与我们所设计的人 DJ-1 siRNA 序列 不存在完全配对，因此，为了进行 DJ-1 干扰回复实验及 DJ-1 过表达实验。我们 利用 pFLAG-CMV-4 真核表达载体，构建耐人 DJ-1 siRNA 的鼠源性 DJ-1 过表达 重组载体 pFLAG-rDJ-1，经 DNA 测序确认后用于后续实验；5. pFLAG-rDJ-1 重组载体或对照空质粒 pFLAG 分别瞬时转染空白对照的 SGC7901 胃癌细胞、稳定转染的阴性对照细胞 SGC7901/NC-siRNA 和 DJ-1 低表 达的胃癌细胞系 SGC7901/DJ-1-siRNA，转染 24 h 后，通过 Western Blot 法检测 DJ-1 蛋白表达变化；采用 MTT 法检测细胞增殖情况；Transwell 小室测定细胞 的迁移和侵袭能力的变化。III结果：1. DNA 测 序 鉴 定 证 实 ， 各 重 组 shRNA 表 达 载 体 包 括 阴 性 对 照 载体 pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA 及靶向 DJ-1 的 3 个重组载体 pGPU6/GFP/Neo- DJ-1-shRNA 1, 2, 3 均构建成功。2. 各重组 shRNA 真核表达载体瞬时转染 SGC7901 细胞后，经 RT-PCR 检 测，阴性对照载体 pGPU6/GFP/Neo-NC