dj1与线粒体应激蛋白mortalin相互作用的研究word格式论文.docxVIP

i imil附lim$111111WJ .， a04!J42浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所虽交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。学位仰者签名:陈赞签字附州|年3月 3 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江大学有权保留并向国家有关部门戒机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江大学可以 将学位论文的全部戚部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位阳路名:陈移 签字 H期: pfl 年 3 月 3 日致谢首先感谢我的导师金静华副教授.两年半的硕士生涯中，一直受到老师悉心 的指导。在这两年半中，我在学业上以及科研上的点滴进步都离不开她对我的严 格指导和要求。您清晰的科研思路，精益求精的学术风格，孜孜不倦的工作态度， 对我今后的人生道路产生深远的影响。感谢罗建红教授对本论文的支持。罗老师为我们创造了非常好的实验平台， 为我们提供了各种学术交流机会，并且时常与我们讨论课题，提出宝贵意见.他 渊博的知识，严谨的治学之道以及宽厚仁慈的品德为我树立了学习的典范.感谢乔森、梁洁、李毅、陈磊、唐欢、潘丹类等同学在研究过程中的帮助。 本论文的究成离不开你们的倾心协助.感谢实验室邱爽、杨巍、钟伟霞、艾恒、邵欣、曹静远、王毓斌、孙鑫、张 彼敏、严颖刚、陆文、张杰、叶茂、严循一等所有老师问学在学术方面给予的指 导和在生活方面给予的关心.感谢孙缓利、周亮、季一飞、苏金风、叶治国等浙 江大学神经所以及浙江大学医学院所有为本论文提供支持的老师同学.最后，感谢家人、朋友对我的支持和理解，你们的鼓励是我不断前进的动力。 本课题受国家自然科学基金项目( 资助DJ-l 与线粒体应激蛋白 Mortalin 相互作用的研究浙江大学医学院硕士研究生导师神经生物学陈梦 金静华副教授 罗建红教授中文摘要背景和目的 :DJ-l 是一个与家族性的帕金森病相关的遗传基因.它编码一个 含 189 个氨基酸的蛋白四 -1. OJ斗蛋白属于ThiJ / PfpI 家族，广泛表达于人体组 织以及脑区.对于 DJ-l 功能的研究，目前主要认为它是一个伴侣蛋白和抗氧化因 子.异常蛋白的错误折叠和线粒体功能缺失是 PD 发病的两个主要机理， OJ-l 在 这个过程中表现保护作用，其功能的缺失或减少将可能导致神经退行性病变.本 课题的前期工作用蛋白组学的方法来筛选与 OJ-l 有相互作用的蛋白。在鱼藤嗣处 理的 MES 细胞中，鉴定出了 306 个与四-1 相关的蛋白， Mortalin 就是其中之一。 Mortalin 是热休克蛋白 70 家族成员之一，它由 679 个氨基酸组成，它的结构与其他 Hsp70 家族成员相似，包括两个结构域: ATP 酶结构域和 C 末端的蛋白结合结构 域.由于它主要定位于线粒体，因此又被称为线粒体热休克蛋白70. 研究表明， Mortalin 参与了多种生理功能的调控，包括细胞存活，细胞增殖，应激，线粒体合 成，细胞内转运等，并且可能在神经系统疾病中发挥作用. Mortalin 与帕企森病的 联系，最早是在分析帕金森病人脑黑质与对照蛋白表达差异中筛选得到的。我们 前期的实验通过定量蛋白组学的方法发现 Mortalin 在帕金森病人的线粒体富集组 分中显著下降.我们这个课题的主要目标就是确定 OJ-l 和 Mortalin 之间的物理性 相互作用，并探究这种物理性相互作用是否会影响功能.11实验方法:1、PC12 和 SH-SY5Y 细胞培养以及细胞转染;2、表达纯化GST 融合蛋白;3、用GS丁 Pull巾阳的方法检测 OJ斗和 Mortalin 的相互作用;4、用免疫共沉淀的方法检测DJ-1 和 Mortalin 的相互作用;5、用细胞免疫荧光化学方法检测OJ-1 和 Mortalin 亚细胞定位情况;6、用M1丁法检测细胞活性;7、用荧光素酶重折叠实验检测蛋白莲折叠功能.实验结果:L、以C灯5 ?小鼠脑组织总蛋白提取物作为 GS丁 P叫U111-dωown体系，用 OJι斗1蛋白作为 诱饵蛋白，我们并没有在沉淀下来的 DJ-1 的蛋白复合物中检测到 Mortalin.2、以C57小鼠脑组织总蛋白提取物， PC12细胞总蛋白提取物，或者 SH在Y5Y 细胞总蛋白提取物等内源性系统作为免疫共沉淀体系，用 OJ-l 蛋白作为诱