dlx5基因促进室管膜前下区神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性细胞分化的实验分析word格式论文.docxVIP

前言中枢神经移植治疗帕金森氏病在当前中枢神经移植研究领域有着突破性的进展[1]，将胚胎中脑黑质多巴能神经元移植到患者纹状体内已经取得了一定的疗效[2，3]，但足量的供体组织获取困难和伦理道德等问题一直阻碍着这一治疗的广泛开展。国内外学者都在尝试基因工程化神经干细胞使之成为多巴胺能神经元以释放多巴胺递质来达到治疗的目的[4-6]。目前，这些研究已经明确：分化得到的多巴胺能神经元移植后可以改善动物模型的症状[7,8]，但是还存在着操作繁琐、困难，表达欠稳定等不足之处。因此，对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究是很重要的，目前这一课题已成为当今神经科学研究的重点和热点。神经干细胞是指中枢神经系统中具有自我更新能力和多种分化潜能的特殊细胞群[9,10]。位于室管膜前下区(Anteriorsubventricularzone, SVZa)的神经干细胞产生后，将沿着一条高度局限化的迁移通道――嘴侧迁移流(Rostralmigratorystream,RMS)以首尾相连的链式(Chain) 模式朝嗅球(Olfactorybulb, OB)迁移[11]，分化成OB神经元，成为出生后嗅球神经元终身更新的来源[12]，其中约70％属多巴胺能（DA）神经元[13]，是中枢神经系统中最大的多巴胺能神经元群[14]。由于这一迁移路径明确，常被作为神经干细胞迁移、分化调控机制研究的理想模型，如图所示。附图室管膜前下区神经干细胞增殖、迁移和分化的解剖学模式图 SVZa：室管膜前下区；RMS：嘴侧迁移流；OB：嗅球；gl：球周细胞层；gcl：颗粒细胞层；CC：: 胼胝体；CTX：皮层；D：背侧；A：前侧。SVZa神经干细胞向OB迁移、分化的过程中，受体内复杂的环境信号的影响。包括很多转录因子类基因如Nurr1、Brn4、Wnts、BMPs、Dlx等[15-20]。Dlx（distall-less homeobox）基因家族中的Dlx5 基因，在中枢神经系统前脑发育的过程中起着非常重要的作用，在SVZ、RMS、OB中都有分布，它与SVZaNSCs 向DA能神经元定向3分化有关[21]。本课题组前期研究已经表明用基因重组技术构建了能在SVZaNSCs 中表达的重组质粒，以此来研究DLX5基因的表达规律及其在神经干细胞的分化中的作用，结果初步证实Dlx5 基因与SVZaNSCs 向神经元分化密切相关[22]，但是分化后细胞的类型尚未确定。因此，本研究在前期结果的基础上以体外培养的SVZaNSCs为研究对象，新构建重组腺病毒穿梭载体质粒，对Dlx5基因在SVZaNSCs向TH阳性细胞分化的影响进行研究。为下一步探讨Dlx5基因在SVZaNSCs分化成TH阳性神经元过程中有何作用，及它通过怎样的一个基因调控网络来实现其作用的研究做准备。对了解SVZa NSCs 在体外条件下定向分化的调控机制有一定的理论价值和潜在的应用价值，如中枢神经移植治疗帕金森氏病。4材料与方法1．实验材料1.1 实验动物新生24h内SD乳鼠，平均体重6.7g，健康清洁级，雌雄不限，贵阳医学院实验动物中心提供[合格证号：SCXK(黔)2002-0001]。实验过程中对动物的处理严格遵循《实验动物管理条例》(1988年)。1.2质粒：1.2.1 模板质粒：mDlx5（法国GiovanniLevi教授馈赠）1.2.2 载体质粒：pDC316-mCMV-EGFP，抗性：Amp1.3主要仪器和耗材仪器名称公司或产地超净工作台(SW-CJ-2FD)苏州安泰公司水套式CO2细胞培养箱（NU-4750E）美国NUAIRE 公司倒置相差显微镜（C-SHG）日本Nikon 公司荧光显微照相装置（DS-U2）日本Nikon 公司解剖显微镜日本Olympus公司超纯水制备系统（CLDJ261301）美国Pal 公司高速低温离心机（CT15RE ）日本HITACHI公司低速离心机（80-2）上海医疗器械厂-80℃低温冰箱美国Asheville 公司-20℃冰箱（BCD-249CF）合肥美菱公司全自动压力蒸汽灭菌器上海博讯公司电热恒温水浴锅（DK-98-II型）天津泰斯特公司雪花制冰机（AF200AS）意大利Scotsman公司落地式培养摇床（Forma481）美国Thermo 公司超微量高精度分光光度仪美国Thermo 公司电泳系统Sub-Cell GT Cell电泳槽美国Bio-Rad 公司鼓风干燥箱（GIX-9000）上海博迅公司电子天平（BP121S）德国Sartorius公司血细胞计数器日本Fein-optik 公司一次性过滤器(0.22μm)美国Millipore公司细胞培养瓶(50ml)美国Costar公司5离心管(15ml/1.5ml)美国Falcon 公司一次性细胞培养板(6 孔、12 孔)美国Cos