碱性磷酸酶的分离纯化鉴定-07-09.pptVIP

常用的蛋白质分离纯化技术 有机溶剂沉淀法 ⑴基本原理 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是： ①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的 介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 ②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水化膜，因而发生沉淀作用。 （2）有机溶剂沉淀法的优缺点 ①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。 其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。 （3）有机溶剂的选择和浓度的计算 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。 （4）有机溶剂沉淀的影响因素 1) 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。 一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。 2) 样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。 通常使用5～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。 分离纯化的一般程序 生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段： ①材料的选择和预处理 ②破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离） ③分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。 操 作 一、取材及匀浆 取兔肝2.5g，剪碎， 加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液，充分匀浆。 定容直7.5ml （取0.1ml留作A液，使用时稀释50倍） 二、提取 加入2.5ml正丁醇，搅拌2min，室温放置30min。过滤，留上清。 三、分离纯化 1、50％丙酮沉淀AKP 加入等体积丙酮，3000rpm×5min，留沉淀 4ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀 （记录体积，取0.1ml留作B液，使用时稀释10倍） 2、30％乙醇溶解AKP 每ml溶液中加入95％乙醇0.46ml 2000rpm×5min，留上清（记录体积） 3、60％乙醇沉淀AKP 每ml溶液中加入95％乙醇0.86ml 3000rpm×5min，留沉淀 4ml 0.01mol/L醋酸镁-醋酸钠溶解沉淀 （记录体积，取0.2ml留作C液，使用时稀释5倍） 4、33％丙酮溶解AKP 每ml溶液中加入0.45ml丙酮 2000rpm×5min，留上清（记录体积） 5、50％丙酮沉淀AKP 每ml溶液中加入0.34ml丙酮 3000rpm×15min，留沉淀 1ml Ph8.8的Tris-醋酸镁溶解沉淀 （D液） 四、分析及鉴定 1、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法） 2、碱性磷酸酶蛋白含量测定（BCA法） 3、比活性及纯化倍数计算 分光光度法（Spectrophotometry） 根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收（即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法（Absorption spectrometry）。 不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来 （一）基本原理 光具有波粒二相性。 波长和频率是光的波动性的特征。 K-- 吸光系数,是物质的特征性常数。 对比法进行定量分析 单色光、平行光（λmax） 溶液均匀、清澈、无散射 溶液性质稳定，比色皿中无化学反应 适用于稀溶液（A 0.2-0.7） 溶剂空白： 当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比溶液。 试剂空白： 当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这种方式最为常用。 基本组件及常见分光光度计 * * * 溶解度 盐析、等