第三章山东师范大学——离体培养的操作技术.pptVIP

第二节 培养和驯化 ? 指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 主要内容： 外植体的选择 外植体的灭菌 外植体的接种和培养 外植体的成苗途径 污染的原因及预防措施 外植体的褐变及其防止措施 培养物的玻璃化现象及其预防措施 一、外植体的选择 什么是外植体（explant）？ 外植体的选择有什么要求？ 外植体(explant) ： 指切离植物体后用以离体培养的各种 接种材料，包括胚胎材料、各种器官、 组织、细胞和原生质体等。 2、外植体选择的要求 选择优良的种质 材料的选择要有目的，具有一定的代表性， 提高成功率，增加实用性。 选择健壮的植株 选取发育正常的器官或组织，再生能力强， 组培易成功。 选择合适的大小 根据不同的植物而异，太大容易污染，太小，多形成愈伤组织甚至难于成活。一般0.5-1.0cm之间。 选择最适的时期 一般按植物生长的最适时期选取材料 外植体的类型 1、茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易 发生遗传变异，但取材有限） 2、茎段（采用嫩茎 的切断促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植 株，取材容易，操作方便，但易发生变异） 4、花球和花蕾 5、种子，根，块根，块茎，花瓣等。 二、外植体的灭菌 外植体的消毒是组培成 功与否的第一关键步骤 外植体的预处理 对外植体进行修整，去掉不要 的部分，在流水下冲洗干净。 外植体的表面灭菌 原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样 常用的灭菌方法： 1）茎尖、茎段及叶片等的消毒： 用清洁剂清洗---75%酒精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次或次氯酸或升汞溶液泡10-15min---无菌水洗3-5次。 2）果实和种子的消毒： 自来水冲洗10-30min---75%酒精漂洗-----无菌水洗3-5次---取出种子培养。 3）根及地下部器官的消毒： 自来水冲洗---75%酒精漂洗---升汞溶液泡5-10min或2%次氯酸溶液泡10-15min---无菌水洗3-5次。 4）花药的消毒： 自来水冲洗---75%酒精浸泡数秒---无菌水洗2-3次---2%次氯酸溶液泡10min---无菌水洗3-5次。 消毒注意事项： 1、表面消毒剂对植物是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。 2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂。 3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需要将其切成，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。 4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。 5、用升汞效果最好，但对人和材料的危害都很大，所以用时要小心，不要弄到皮肤上，材料用后要用水冲洗至少5次。 三、外植体的接种和培养 （一）外植体的接种---无菌操作 是将表面灭菌的植物材料切碎或分离出器官、组织、 细胞，转放到无菌培养基上的全部过程。整个接种 过程均需无菌操作。 四、外植体的成苗途径 1、愈伤组织途径 愈伤组织 外植体 芽 根 试管苗 根、芽 根 芽 如安祖花的组织培养就属此类途径 2、胚胎发育途径 外植体 胚状体（原胚期、球形胚期、 心形胚期、鱼雷形胚期、子叶期） 试管苗 3、直接成苗途径 外植体 根、芽 试管苗 如茎尖培养就属于此类 五、污染的原因及其预防措施 一）污染的原因 二）污染的预防措施 1、污染：植物组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌， 导致培养失败的现象 2、污染的原因：一是病原菌污染（细菌、真菌） 二是外植体、培养基、培养器皿带菌 三是操作人员未遵守操作规程。 真菌污染 污染的预防措施 组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。 1、防止材料带菌 2、防止用具带菌 3、操作室要处于无菌状态 4、操作人员要按照操作程序进行 褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组