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FAK对不同分化状态的神经干细胞定向迁移的调控研究中文摘要中文摘要神经干/祖细胞（Neuralstem/progenitorcells，NSCs）的迁移对哺乳动物神经系统的发育和损伤修复至关重要。许多神经退行性疾病的发生是由于NSCs迁移缺陷导致的，所以激发内源或外源移植的NSCs向神经损伤部位的迁移，是治疗神经性疾病的关键因素。我们的前期研究已表明，血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）诱导的NSCs趋化迁移与其分化状态、粘着斑（focaladhesion,FA）动态变化及肌动蛋白（F-actin）细胞骨架重塑相关。粘着斑激酶（focaladhesionkinase,FAK）作为胞质酪氨酸激酶，在生长因子介导的信号通路及细胞迁移过程中起着关键作用，然而其在NSCs的趋化迁移过程中的作用还未被知详。本实验研究将探讨在不同分化状态的NSCs趋向VEGF的迁移过程中，FAK对FA的动态变化和分布的调控作用，及其与PI3K/Akt、MAPKs和Rac1信号通路之间的相互调节机制。利用C17.2 NSCs进行趋化迁移实验发现，PF573228（FAK抑制剂，简称PF-228）抑制FAK 活性后，显著抑制了VEGF诱导的不同分化状态的细胞趋化迁移：Boydenchamber群体细胞迁移实验，未分化、分化1 d和分化3 d的NSCs的迁移数量均减少；Dunnchamber单细胞趋化迁移实验，未分化和分化1 d的NSCs向VEGF的趋化迁移明显受抑，细胞的迁移速度降低，迁移持续性也下降。另外，PF-228显著抑制VEGF诱导的胎鼠大脑皮层神经球和大鼠SVZ神经球的铺展及迁移，神经球的铺展半径减小，细胞迁移的速度也降低。FA在细胞迁移过程中呈不断形成-解聚的动态周转状态，FAK可以通过影响FA的形成及动态组装从而调控细胞迁移。免疫荧光染色发现，细胞在VEGF诱导下易伸出伪足，胞内的微丝结构发生重塑。许多小斑点样的FA在片状伪足处形成，FA的总数量增加。而在PF-228作用下，FA总数量减少，新生FA比例下降，成熟FA比例增加，说明不仅FA的形成受到抑制，而且成熟FA的解聚也受阻。并且在PF-228作用下，VEGF促进的pY397-FAK和pY31/pY118-paxillin的磷酸化作用显著下调。细胞迁移至划痕区域过程中，VEGF诱导的新生FA主要分布在铺展的片状伪足处，前后FA 极性分布比例较大，而PF-228处理后，成熟稳定的FA仅局限分布在细胞边缘。相应的，活细胞跟踪观察FA动态变化发现，VEGF显著提高了FA的周转速度，FA的组装加快，在细胞迁移前端不断形成小斑点FA，细胞尾端的FA也快速解聚；而PF-228作用下，细胞周边的FA斑点较大，周转缓慢，细胞尾端的FA解聚也较慢。转染FAK活性突变体发现，pRKGFP-FAK能够响I应VEGF的刺激，FA数量变多，长度变短，而FAK-Y397F失活型指示的FA显著长于pRKGFP-FAK指示的FA，并且不响应VEGF的刺激，FA没有变化。说明FAK的Y397位点的活化在FA动态变化中起着关键作用。PF-228抑制FAK活性后，不同程度的抑制了PI3K/Akt和MAPKs信号通路的下游分子，包括Akt、ERK1/2、SAPK/JNK和p38MAPK的磷酸化作用，所以FAK影响细胞迁移及FA形成可能与PI3K和MAPKs信号转导通路有关：抑制PI3K/Akt或MAPKs信号通路，不同程度的阻碍了大鼠SVZ神经球的迁移及VEGF诱导的细胞迁移，特别是ERK1/2和SAPK/JNK信号通路显著长效的抑制了神经球的铺展；不同分化状态的FA形成也受到不同程度的抑制；划痕迁移过程中，细胞不具明显的极性形态，细胞前后端FA的极性分布比例也降低；Western blot也发现，VEGF 诱导的FAK和Y31/118-paxillin的磷酸化也减弱，说明在细胞迁移及FA动态周转过程中，FAK 与PI3K/Akt和MAPKs通路之间可能是相互调节的作用机制。最后，我们检测了调控F-actin细胞骨架的Rac1-GTPase在VEGF诱导的细胞迁移和FA形成中的作用。过表达Rac1激活型突变体Rac1-Q61L和Rac1-G12V，细胞趋化迁移的效率显著升高，片状伪足的伸展具有方向持续性，并且FA的数量显著增多。而转染Rac1显性阴性突变体Rac1-T17N，FA的数量较少，说明活化的Rac1促进FA形成，失活的Rac1抑制FA形成。在VEGF 刺激下，pIRES2-GFP对照细胞和Rac1野生型细胞中的FA增加，而Rac1-Q61L和Rac1-G12V的细胞中的FA数量没有进一步增多，Rac1-T17N的细胞也不响应VEGF的刺激，说明VEGF诱导的FA形成