非小细胞肺癌患者外周血cd4cd25cd127-t细胞和tgf-β1检测的临床意义word格式论文.docxVIP

研究主要内容1.研究对象肺癌患者46 例（来自蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科住院和门诊患者），均经病理学证实,其中男37例,女9例,年龄25-86岁,平均(59.1±11.3)岁.组织学类型:鳞癌19例、腺癌24例、细支气管肺泡癌3例.因细支气管肺泡癌例数较少统计时将其归为腺癌范畴.根据UICC2009版的TNM标准进行临床分期:I期2例、II期14 例、Ⅲ期14 例、Ⅳ期16 例.对照组:健康献血者20 例,男12 例,女8 例,年龄28-76 岁,平均(55.4±13.6)岁.实验对象必须满足以下的条件：(1)患者为初治,经细胞学或病理学证实为非小细胞肺癌且不伴有自身免疫性疾病,未经化疗以及其他抗肿瘤治疗.(2) 复治患者近1 个月未做过抗肿瘤治疗，3 个月未使用过免疫增强剂.(3) 采取标本之前未使用糖皮质激素和非甾体类药物.(4) 所有病例排除免疫相关性疾病.2.实验试剂小鼠抗人CD25-FITC荧光单克隆抗体试剂、小鼠抗人CD127-PE荧光单克隆抗体试剂、小鼠抗人CD4-PerCP荧光单克隆抗体试剂(美国BDBiosciences公司); 人TGF-β1ELISA检测试剂盒(上海森雄公司).主要设备仪器流式细胞仪BDFASCalibur（美国BD公司）电脑（流式细胞仪处理数据）美国苹果公司酶标仪anthos labtel instruments（澳大利亚）离心机TDL80-2B上海安亭科学仪器厂电热恒温水槽SKB-8A 上海医疗器械七厂-20 度冰柜海尔公司-80 度冰柜日本三洋公司3.实验主要操作步骤分别采集肺癌组及健康献血者外周静脉血2ml 肝素抗凝;进行CD4+CD25+CD127-Treg的检测大约用去0.5ml的血液，将另外1.5ml的血液分离血清,编号置-80℃冰箱保存备测.3.1 流式细胞检测的主要步骤（1）取2 个流式试管并标号Tr1 和Tr2.（2）在Tr2管中分别加入CD4-PerCP20μl，CD25-FITC20μl以及CD127-PE4μl。两管中均加入60μl 的全血，避光室温放置15 分钟.（3）取出试管各加入2ml 的溶血素，避光放置10 分钟.（4）1500rnp 离心5 分钟去上清液.（5）加入2ml 的PBS,1500rnp 离心5 分钟，去上清液.（6）加入2ml 的PBS进行流式细胞仪检测.最后用CellQuestv3.2软件获取及分析,计算外周血中CD4+CD25+CD127-Treg占CD4+淋巴细胞比例.TGF-β1ELISA检测的主要步骤3.2.1 样本的准备：将冷藏的血清标本从冰柜取出，解冻.3.2.2 标本的激活：（1）将450ul 样品稀释液加入到一支1.5ml 聚丙烯管中，再加10ul 待测标本.（2）加20ul N HCL,盖紧，上下混匀.2-8℃放置60±2 分钟.（3）加20ul N NAOH,盖紧，上下混匀.（4）即用，或放-20/-70℃保存3 天.试剂的准备(1)标本液配制：使用前每管中加入蒸馏水200ul 溶解后即可. (2)洗涤液：用重蒸水1：20 稀释.(3)底物工作液配制：显色前5-10分钟将OPD片放入底物稀释液中溶解，每片加液5ml.检测程序（1）实验前20 分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（20-25℃）.（2）取出所需数量的板条，其余密封放回4℃.（3）建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100ul，在第一孔中加标准品100ul,混匀后用加样器吸出100ul.移至第二孔.如此反复对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸取100ul 弃去使之体积均为100ul.第八孔为空白对照组.（4）加样：把待测品孔，每孔中各加入已激活的标本100ul.（5）将反应板放置37℃120 分钟.（6）洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6 次，向滤纸上吸干.（7）每孔中加入第一抗体工作液50ul.（8）将反应板充分混匀放置37℃60 分钟.（9）洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6 次，向滤纸上吸干. (10)每孔加酶标抗体工作液100ul.(11)将反应板充分混匀放置37℃60 分钟. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6 次，向滤纸上吸干. (12)每孔加入底物工作液100ul,置37℃暗反应区5-10 分钟. (13)每孔中加入50ul 终止液混匀.(14)在492nm处测吸光值. (15)结果计算与判断:a.所有OD 值都应减除空白值后再行计算.b.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/ml 之OD值在本对数纸上作图，画出标准曲线.将浓度作为X轴（对数轴），OD值作为Y值（线性轴）. 曲线应为一光滑的曲线.根据样品OD值在该曲线上的作图，查出相应人TGF-β1.（此时所查出