华南地区猪群中葡萄球菌分离鉴定及猪葡萄球菌exhc毒素基因原核表达word格式论文.docxVIP

目录1引言11.1国内外研究的概况11.2病原学31.3流行病学31.4生物学特性及脱落毒素41.4.1生物学特性41.4.2脱落毒素41.5临床症状61.6诊断方法71.6.1细菌学方法71.6.2分子生物学方法71.6.3血清学诊断71.7治疗与预防81.7.1治疗81.7.2预防81.8研究目的及意义92葡萄球菌的初步分离鉴定及药敏试验102.1材料与方法102.1.1材料培养基及试剂实验动物主要仪器培养基的配制102.1.2方法病料采集细菌的分离革兰氏染色镜检生化鉴定112.1.5动物致病性试验药敏试验分离菌株的菌种保存122.2结果与分析122.2.1临床症状122.2.2细菌分离122.2.3生化鉴定122.2.4动物试验142.2.5药敏试验142.3讨论153猪群中葡萄球菌GAP基因、16S RRNA基因的克隆及系统进化分析163.1材料与方法163.1.1材料菌种与载体试剂主要仪器设备主要溶液配方163.1.2方法引物17基因组DNA的抽提17PCR扩增凝胶电泳PCR扩增产物的回收目的片段与载体的连接大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)连接产物的转化GAP基因、16SRRNA基因核苷酸序列测定及遗传进化分析213.2结果与分析21GAP基因的PCR扩增结果2116SRRNA基因的PCR扩增结果213.2.3GAP基因核苷酸序列遗传进化分析223.3讨论234猪葡萄球菌毒素基因检测方法的建立244.1材料与方法244.1.1材料菌种与载体试剂主要仪器设备主要溶液配方244.1.2方法引物25基因组DNA的抽提25PCR扩增凝胶电泳2连接产物的转化284.2结果与分析284.3讨论295GDZC株猪葡萄球菌EXHC毒素基因原核表达载体的构建295.1材料与方法295.1.1材料2菌株及质粒30主要试剂30所需主要试剂的配制305.1.2方法3引物设计32基因组DNA的抽提32GDZC菌株的EXHC脱落毒素基因的PCR扩增3GDZC菌株的EXHC基因的克隆及序列分析3GDZC菌株的EXHC毒素基因重组表达载体的构建3GDZC菌株的EXHC毒素基因的诱导表达335.2结果与分析34GDZC株GAP基因的PCR扩增结果34EXHC毒素基因的PCR扩增结果345.2.3GDZC菌株的GAP基因及EXHC毒素基因的序列分析结果355.2.4GDZC菌株EXHC毒素基因重组表达载体的构建355.2.4GDZC菌株EXHC毒素基因的诱导表达365.3讨论376结论38致谢40参考文献41作者简介45缩略语表EE SH ETTEMEDS.aureusμL mgExudativeEpidermitis Staphylococcushyicus Exfoliativetoxins Tetramethylethylenediamine Staphylococcusaureus microlitermicrogram渗出性皮炎猪葡萄球菌表皮脱落毒素四甲基乙二胺金黄色葡萄球菌微升毫克E.coliEscherichiacoli大肠杆菌PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应bpbasepair碱基对KDKilodalton千道尔顿IUInternationalunit国际单位DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸KanaKanamycin卡那霉素AmpAmpicillin氨苄青霉素LBLuria-BertaniLB液体培养基PBSPhosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲溶液gGram克hHour小时r/minRotational speedin revolutionsperminute转/分钟ELISAEnzyme linked immunosorbent assay酶联免疫吸附测定IPTGIsopropy-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷SDSSodium dodecyl sulfatepolyacrylamide十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺1引言仔猪渗出性皮炎(Exudativeepidermitis，EE，又称“猪油皮病”)是一种以急性全身性渗出性皮炎为特征，具有高度接触性的传染病[1]。本病主要感染5-6日龄的初生哺乳仔猪、刚断奶的仔猪，与母猪的子宫炎、乳房炎也有直接的关系[2]。该病一旦感染猪群可造成大批哺乳仔猪和断奶仔猪死亡。猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)为猪渗出性皮炎的主要病原，属于葡萄球菌属成员，在猪、家禽以及患有乳房炎的奶牛和绵羊的乳汁中均可分离到此菌，为革兰氏阳性球菌。Sato等[3]研究发现脱落毒素的产生是S.hyicus毒力最重要的决定因素之一。丹麦和日本的研究者先后发现了脱落毒素，Andrese