解读基因组序列课件.pptVIP

5.3.1标注酵母基因组序列 酵母菌基因组测序在1996完成。最初的分析将100个密码子设为可能存在基因的最小长度，鉴别出6274个ORF,其中大约30%的ORF是已知真正的基因。剩下的70%运用同源性分析进行了研究，得到了一些结果： 1.用同源性搜索序列数据数据库，可以确定出基因组中大约30%基因的功能。其中有一半很明确是功能基因的同源基因，另一半没有明显的相似性，包括许多相似性仅限于个别结构域的基因。 2.酵母所有基因大约有10%在数据库中有同源基因，但这些同源基因的功能未知。因此同源性分析不能帮助确定这些酵母基因的功能。这些酵母基因及其同源基因称作孤儿家族。 3.剩下的总数的大约30%，在数据库中没有同源基因。其中大约总数的7%是有疑问的ORF，其长度很短或有异常的密码子偏倚，可能不是真正的基因。另外的大约总数的23%像基因但是唯一的，被称为单一孤儿。 对酵母基因组序列进行初步标注后，有两个重要的问题： 1.单一孤儿中有多少为真正基因？ 2.是否有一些真正基因因为长度小于100个密码子，所以不能通过最初分析鉴定出来？酵母基因组中长度大于或等于100个密码子的ORF只有6274个，但长度大于或等于15个密码子的ORF有100000多个，它们中的大多数表现出的密码子选择模式与真正的酵母基因无差别，因此发现新的小基因的潜力是很大的。 可以用前面介绍的三种方法来筛选酵母基因： 1.比较基因组学 利用相关酵母物种的一组基因组序列，来评价许多小ORF的真实性。 2.通过对cDNA进行测序寻找转录的证据，包括表达序列标签的文库，基因表达系列分析，微阵列研究。 3.转座子标记 像用来通过失活基因进行功能分析一样，也用来鉴定真正基因的ORF。 在正常细胞中lacZ基因是失活的，用X-gal测试时，克隆显白色。被激活后，克隆显蓝色。有疑问的ORF就可根据克隆的颜色鉴定出来。 2 确定酵母基因的功能 酿酒酵母有两大特征可帮助确定其基因组中未知的基因功能。 1.具有高的同源重组的自然倾向，这就比较容易运用该方法来失活单个基因。 2.基因组中存在转座子Ty家族，这就将转座子标记技术用作基因失活。 现在面临的挑战是发展能筛选大量突变体的方法，以找到能表明失活基因功能的特异表性特征。若同时进行许多平行实验，需要大规模的筛选策略。 这些筛选方法中最成功的方法是条形码删除策略。 这是基本缺失盒系统的改进形式，它们的区别是缺失盒同时还含两个20个核苷酸的“条形码”序列，每种缺失的序列是不同的，因此可作为特异突变体的标签。 每个条形码两侧的序列是相同的，因此可以通过单个PCR反应进行扩增。这就表明，一群突变的酵母株可以混合在一起，每种酵母株含有一种不同的失活基因，就可以在单次实验中筛选它们的表型。 现在，大约有55%的酵母基因已经通过一种或多种实验方法明确了它们的功能。明确功能的基因有1500多个，比基因组序列刚被测通过时的情况好得多。另外约占总数33%的2000个基因是根据同源性分析而确定功能的。只剩下500个ORF被认为是真正基因，但功能未定，另外300个有疑问的ORF可能不是真正的基因。 3 总结 当获得基因组序列时，最初的目标是对所有基因进行定位。 以计算机为基础的定位方法： 1.对于蛋白质编码基因来说，可尝试寻找ORF进行定位。 2.可以通过寻找功能RNA基因的特征对它们的进行定位，最基本的是RNA折叠成二级结构的能力是以碱基配对的颈环结构信息为依据的。 3.也可以通过 同源性分析对基因进行定位，同源性分析将第二种基因组中存在同源基因作为推测待测基因组中的假定基因是真正基因的依据。 用户注册 --- 3.注册成功  基因定位的实验方法是以检测从基因组中转录出的RNA分子为基础的。 包括：通过逆转录PCR或异源双链分析进行cDNA测序和转录物作图。 对于基因功能的确定： 1.通过同源性分析，因为同源基因在进化上是相关的并经常具有相似功能。 2.实验方法大都包括检查基因失活对生物体表型的影响。可以用不同的方法实现基因失活：a 用有缺陷的基因进行同源重组 b 将转座子插入到基因中c RNA干扰 3.基因过表达也可用来评价基因的功能。 4.通过定点诱变可对基因功能进行更详细的研究，而且可以通过报道基因的表达或免疫细胞化学确定蛋白质的细胞定位。 * * * * * * 将RNA做起始材料进行特殊类型的PCR 逆转录PCR（reverse transcriptase PCR,RT-PCR）快速扩增cDNA末端 其他的转录物准确作图的方法包括异源双链分析（heterodu