猪链球菌2型MRP截短基因原核表达及生物学活性研究.pptVIP

研究生 学科 指导教师 ：李 耿 ：兽医微生物与免疫学 ：雷连成 副教授 猪链球菌2型 猪链球菌2型（SS2）是一种重要的人畜共患传染病病原，可引起猪关节炎、脑膜炎、肺炎、败血症、心内膜炎、流产及脓肿等，发病率和死亡率均较高，并可感染人甚至致死。 SS2在世界范围内广泛存在，在我国1998年和05年两次爆发，造成数十人死亡，对我国畜牧业和社会产生极大的危害。因此应该对其进行深入地研究，以建立有效的监测、防御措施 MRP SS2有多种毒力因子，而溶菌酶释放蛋白（MRP）是其重要的毒力因子之一；MRP为130kD、多表位胞壁蛋白，具有黏附、抗吞噬等作用， MRP可以凝集血红细胞，是SS2引起败血症的机制之一；MRP可以黏附微血管上皮细胞，是SS2穿越血脑屏障引起脑膜炎的机制之一。 MRP具有较高的免疫保护原性，可以利用它研制亚单位疫苗以填补目前市场SS2疫苗的不足。 但是，究竟是MRP哪一个表位可以凝集血红细胞或黏附微血管上皮细胞等、SS2穿越血脑屏障后对神经胶质细胞等的进一步作用尚未见报道。因此有必要进一步研究其致病机制。 MRP具有较高的免疫保护原性，可以利用它研制亚单位疫苗以填补目前市场SS2疫苗的不足。 由于天然蛋白不易获得，而MRP基因过大，不易全部表达获得，因此本实验拟获取MRP功能片段，从细胞活性及免疫原性两方面着手，确定该片段是否即MRP免疫保护性、血凝活性、抗吞噬等活性的功能表位，从而为进一步研究MRP致病机理及以后对其抗原表位的研究奠定基础，同时为以后研制SS2亚单位疫苗控制该病奠定基础。 MRP截短基因的选取，克隆， MRP截短基因的原核表达，纯化 截短MRP的免疫保护原性 截短MRP的其他生物学活性 1.功能基因的选取：本试验参照GeneBank中X64450序列，通过网络进行二级结构分析及抗原表位预测，选取了高度保守的第616～1959位基因的功能片段，设计了一对引物，以SS2国内标准株CVCC606为模板，PCR扩增得到目的基因。 2.克隆载体的构建：将目的基因连接于pMD18-T simple vector , 转化到DH5α感受态中，挑取阳性菌进行测序 3.表达载体的构建：从克隆载体中酶切得到目的基因，连接于pGEX-3x,转化到DE3细胞中，挑选阳性菌株测序 4.表达、纯化：用IPTG诱导，并优化可溶性表达条件(IPTG浓度、温度、时间等)；融菌酶裂解细菌，取裂解上清用谷胱甘肽亲和层析柱纯化目的蛋白。 5.免疫保护性研究：以纯化蛋白免疫BALB／C 小鼠后，用10倍于最小值死量的SS2606活菌攻毒，计算免疫保护率 6.血凝活性检测：猪血红细胞凝集试验及半乳糖阻断试验 7.MRP介导的SS2606抗吞噬细胞吞噬作用 结 果 1.成功获得了目的基因片段，并获得了表达载体 2.可溶性表达条件的优化 创 新 之 处 首次获得该段截短MRP，并对该蛋白进行功能性研究。 首次研究该段截短MRP对小鼠感染SS2的免疫保护性。 以该段截短MRP为代表，首次研究MRP对神经细胞是否有毒性作用。 年 度 计 划 资料查询（2006.3～2006.5） pMD18-T-MRP`克隆载体的构建(2006.6) pGEX-3x-MRP`原核表达载体的构建及表达、纯化(2006.7～2006.9) 猪链球菌2型MRP截短基因表达产物生物学活性鉴定、研究（2006.10～ 2007.2） 论文撰写、准备答辩（2007.3～2007.5） 敬请 各位专家 批评指正！ * * * 猪链球菌2型MRP截短基因原核表达  及生物学活性研究 研 究 内 容 研究方法和手段 研究方法和手段 目的基因的选择、PCR扩增 pMD18-T-MRP`克隆载体的构建 pGEX-3X-MRP`表达载体的构建 IPTG诱导表达 谷胱甘肽亲和层析纯化蛋白 生物学活性研究 凝集猪 血红细 胞活性 的检测 抗吞噬 细胞吞 噬活性 的检测 免疫 保护性 试验 技术路线 1 2 3 4 5 49bp 1343bp 1：26 1：28 1：28 tmrp 1：25 1：28 1：27 CVCC606 37 ℃ 室温 4℃