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液氮保藏法 液氮保藏法是目前保存微生物菌种最可靠的方法，多数国家级菌种保藏单位 都采用此法。 1 准备安培管 用于液氮保藏的安培管，要求能耐受温度突然变化而不致破 裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安培管。安培管的大小通常使用 75×10mm的安培瓶。 2加保护剂与灭菌 保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将 空安培管塞上棉塞，在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌15min；若保存霉 菌菌丝体则需在安培管内预先加入保护剂，如 10%的甘油蒸馏水溶液或10%二 甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌种块为限，而后再进行高压灭 菌。 3接入菌种 将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安培 管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的 安培管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。 4冻结 再将已封口的安培管以每分钟下降1℃的慢速冻结至－30℃。若细胞 急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。 5保藏 经冻结至－30℃ 的安培管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然 后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为－150℃，液态氮为－ 196℃。 6 恢复培养 保藏的菌种需要用时，将安培管取出，立即放入38～40℃的水 浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安培管，将内容物移到适宜的培 养基上培养。 此法除了适宜于一般微生物的保藏外，对于一些用冷冻干燥法都难以保藏的 微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞都 可长期保藏，而且不易发生变异。缺点是需要特殊设备。 关于液氮复苏样品的方法及建议： 方法一： 准备吸水纸两张，干净毛巾一条。 1.在地面或是桌面上铺两层干净吸水纸。 2.迅速从液氮罐中取出冻存管后，放在吸水纸上（注意一定要将冻存管放到，不 要直立起来，因为直立起来的冻存管内液氮很难在短时间内挥发出来，而放平以 后，液氮会快速从管缝隙中渗漏出来） 3.用干净毛巾罩住冻存管样品（还是为了防止爆炸造成伤害），大约3-5min即可 进行后续试验。 纯属个人经验，希望对大家有所帮助。 方法二： 1. 4 30 -20 60 -80 要按照冻存的严格步骤（将冻存管置于 ℃ 分钟 ℃ 分钟 ℃过 夜液氮罐）一步步来。 2.拧紧盖子后，还用白胶布缠一圈，普通药店有卖的。就是打吊瓶时候粘针头的 那种白胶布。这样会好一些，不过仍然会进去点。从液氮罐里取出提篮时应缓慢， 然后取出冻存管，室温下放十几秒（注意一定要将冻存管放到，不要直立起来。）， 用带棉手套的手拿着冻存管管盖处，置于37度水中融化。 3.在整个操作过程中必须穿戴保护服，包括手套，脸罩等。 纯属个人经验，希望对大家有所帮助。 方法三： 使用Nunc 冻存管，机械密封的冻存管必须密封在保护袋中。Nunc 提供 CryoFlex 密封管，热密封的聚乙烯管专门为Nunc冻存管密封设计。将冻存管在 液氮液相中冻存而没有使用CryoFlex 密封管是十分危险的，冻存管在液氮液相 中冻存必须使用CryoFlex 密封管进行热密封。 警告：不要使用Nunc 的冻存管在液氮液相,除非正确的将冻存管密封在Nunc CryoFlexTubing(Cat. No. 343958)中。若不正确使用冻存管，液氮会进入冻存管 中导致压力上升，发生爆炸或者生物泄漏安全事故。正确使用方法可以参考Nalge NuncInternationalCryopreservation Manual。 当冻存管储存在液氮液相中而没有使用CryoFlex Tubing 时,复苏时应将冻 24h 存管从液氮液相取出后必须在液氮气相中储存 ，这样可以使得液氮从冻存管 中慢慢的蒸发和逃逸，从而降低冻存管中的压力。等在液氮气相储存24h后，将 冻存管放入水浴槽，同时用毛巾覆盖，等熔融复苏结束后转移冻存物。此方法也 可在方法一及方法二中作为前处理使用。 整个操作过程中必须穿戴保护服，包括手套，脸罩等。 纯属个人经验，希望对大家有所帮助。