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第十章 电泳 电泳（electrophoresis） 本章提要： ?基本原理 ? 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ? 琼脂糖凝胶电泳 ? 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ? 等电聚焦电泳 ? 高效毛细管电泳 ? 双向电泳（二维电泳） 电泳： 定义：带电颗粒在电场作用下，向相反电极移动的现象，称为电泳。 第一节 基本原理 q E υ ＝ 6πr ·η q E υ ＝ 6πr ·η 带电粒子在电场中的泳动速度： ?与电场强度E和带电量q成正比； ?与粒子半径及介质粘度成反比。 泳动度 泳动度（m）或迁移率：单位电场中的泳动速度 υ d/t d · L m＝ = = (m2/V·s ) E V/L V · t 影响迁移速度的因素 1、颗粒性质：颗粒直径、形状、所带电量 2、电场强度E：E越大，则泳动速度越快 3、溶液性质： ? pH： ?离子强度：在0.02～0.2之间较为适宜 ?粘度：迁移速度与介质粘度成反比 4、电渗： 因支持物上存在离子基团，它会吸引溶液中的离子。在电场中，溶液层相对于固定固体有相对移动，这种现象称为电渗－－即：溶液层的泳动现象。 ?当颗粒泳动方向与电渗方向一致时，加快颗粒泳动速度； ?当颗粒泳动方向与电渗方向相反时，降低颗粒泳动速度； ?当电场力＝电渗力时，颗粒泳动速度为零。 5、焦耳热 Q＝I2 · R*t 电泳过程中放出的热量 6、筛孔 支持物筛孔会影响泳动速度，筛孔过小→υ↓↓ 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ?聚丙烯酰胺凝胶电泳:polyacrylamide gel electrophoresis, 简称：PAGE ?以聚丙烯酰胺凝胶为支持物； ?是目前研究蛋白质、核酸等大分子的重要工具。 PAGE的优点 ?孔径大小可调节：具有筛分效应； ? PAG凝胶机械强度好，弹性大，非离子型，电渗力低，分辨率高，重复性好； ?应用广。 2.1 聚丙烯酰胺凝胶的合成 2.1.1 聚合反应 聚丙烯酰胺凝胶是由 单体：丙烯酰胺（Acr） 交联剂：亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 2.1.2 催化系统 （1）化学催化系统 引发剂：过硫酸铵 （NH4）2S2O8，简称AP 加速剂：四甲基乙二胺，简称TEMED （2）光催化系统 引发剂：核黄素Vb2（光激发） ?交联度C ： a/b值对凝胶筛孔、透明度、机械强度有影响 2.2 PAGE的分离原理 2.2.1 盘状电泳的装置（不连续垂直柱状凝胶电泳） 系统由3种不连续的凝胶组成： 2.2.2 作用原理（以分离酸性蛋白质的碱性（高pH）系统为例） 在盘状电泳过程中，有三种物理效应： （1）样品的浓缩效应－－发生于浓缩胶中 （2）凝胶的分子筛效应－－发生于分离胶中 （3）电泳的电荷效应－－浓缩胶、分离胶中 第一个效应：样品的浓度效应（发生于浓缩胶中） 基于电泳基质的4个不连续性： 1、凝胶层的不连续性：3层不同的凝胶 ?样品胶： ?浓缩胶： ?分离胶： 2、缓冲液离子成份的不连续性 ?快离子（先行离子）： ?慢离子（随后离子）： ?缓冲配对离子： 缓冲液： 电极缓冲液：pH8.3，Tris/甘氨酸缓冲液 样品胶、浓缩胶：pH6.7 ，Tris/HCl缓冲液 分离胶：pH8.9，Tris/HCl缓冲液 浓缩效应： 样品胶、浓缩胶：pH6.7 Tris/HCl缓冲液 Gly：少量－COOH电离，（pI甘＝6.0） 有效泳动率：mCL－ αCl－m蛋α蛋 m甘－α 甘－ 3、电场强度的不连续性 ?电泳开始时： 快离子（Cl－）泳动率最大，很快超过蛋白质，在快离子后形成低离子强度区，即低电导区； 低电导区产生高电场（E=I/?， ?为电导率）； 使蛋白质、慢离子加速移动（v=mE） 当三者（Cl－、蛋白质－、甘－）移动速度相等时，建立稳定状态： 在快、慢离子之间形成稳定而又不断向阳极移动的界面。 蛋白质被浓缩为一个狭窄的中间层。 第二个效应：分子筛效应－发生于分离胶中 分子量不同、分子构型不同的蛋白质样品通过一定孔径的小孔径分离胶时，受到的阻滞程度不同，表现出不同的泳动率 －－－这就是