SDS在HCV基因工程抗原包被中的应用研究.pdfVIP

第 23卷 第 3期 广西师范大学学报 (自然科学版) Vo1．23 N0．3 2005年 9月 JOURNALOFGUANGXIN0RMALUNIVERSITY Sept． 2005 SDS在 HCV基因工程抗原包被中的应用研究 于成德 ，宋德贵 ，吴建国。，杨生玉 (1．河南大学 生命科学学院，河南 开封 475001；2．广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541004 3．武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072) 摘 要：在间接 ELISA法检测HCV抗体过程中，通过使用含有十二烷基硫酸钠(SDS)的包被液对HCV基因 工程抗原固相化，发现使用 SDS提高了HCV间接 ELISA法诊断试剂检测的阳性标本和阴性标本的偏 比，改 善了反应模式，为改善 HCV—ELISA法诊断试剂的质量提供了有效途径． 关键词 ：生物工程 ；十二烷基硫酸钠 (SDS)；包被液 ；HCV基 因工程抗原 中图分类号 ：Q81 文献标识码：A 文章编号 ：1001—6600(2005)03—0070—04 我们使用检测抗 HCV(丙型肝炎病毒)核壳蛋 白和抗 NS3区 ／NS5区抗体的HCV基因工程抗原作为 包被抗原 ，进行间接 ELISA法检测的过程 中 ¨，发现在 HCV基因工程抗原包被液中使用一定浓度的十二 烷基硫酸钠 ，提高了酶标板包被后 阳性标本均值和 阴性标本均值之 间的偏 比，优化 了反应模式 ，为改善 HCV间接 ELISA法诊断试剂的质量提供了有效途径 ，现报道如下． 1 材料和方法 1．1 HCV基因工程抗原的包被 实验使用的HCV基因工程抗原和聚苯 乙烯微孔酶标板购 自郑州创生生物工程公司，辣根过氧化物 酶购 自Sigma公司，其他化学试剂是国产分析纯试剂或优级纯试剂． 以一定浓度把基 因工程抗原溶解于包被液 A 中，即 50mmol／LpH9．6碳酸盐缓冲液 (15mmol／L NaCO。，35mmol／LNaHCO。，0．2mg／LNaN3)，通过 4。c放置 12h完成包被过程 ；与此同时，使用和包 被液 A相 同的抗原包被浓度把 同一批基因工程抗原溶解于包被液 B中，即 50mmol／LpH9．6碳酸盐缓 冲液 (15mmol／LNa2CO3，35mmol／LNaHCO3，0．2mg／LNaN3)，加SDS至其终浓度为 1mmol／L，通过 4℃放置 12h完成包被．用于包被的基 因工程抗原浓度一般为 1～10ng／L，在聚苯乙烯微孔酶标板的每 个 凹孔内加 100 L 我们使用方阵法滴定选择基 因工程抗原最适工作浓度 ，把抗原在包被液中作系列稀 释(1：500～1：8000)，分别进行包被．取 出酶标板 ，去残余包被液 ，酶标板孔用洗液 PBS—T(pH7．4 0．01mol／L磷酸盐缓冲液，0．85 NaC1，0．0595／Tween20)洗 1次 ，在滤纸上拍干；然后取强阳性 、弱阳性 和阴性参考血清各 1份 ，在酶标板 的每孔中加 100 I样品稀释液 (0．3 明胶 ，0．5 BSA，5 小牛血清 ， 0．3 TritonX一1O0，0．2mg／LNaN3，0．02mol／LPBSpH7．4)，每孔加入待检血清 5 L，即 1：20稀释血 清标本．每板设阴、阳性对照备 2孔 ，空 白对照 1孔 ，震摇混匀，37℃温育 30min，取 出酶标板 ，弃去样品， 以PBS—T洗 5次 ，在滤纸上拍干 ；然后 ，每孔加工作浓度的酶标二抗 100 L(0．5％BSA，0．596／山羊血清 ， 0．075％Tween20，0．0159／6硫柳汞钠盐 ，0．02mol／LPBSpH7．4的酶标稀释液)，37。C温育 30min，弃掉 酶标二抗 ，以PBS—T洗涤 5次 ，在滤纸上拍干；拍干后 ，每孔加入 50 L底物 HO ／TMB，TMB为 四甲基 联苯胺．37。C显色 20min，用 2mol／LHSO 终止反应 ，分别在 450nm处测定OD值 ，空白孔OD值调零 后 ，选择强阳性参考血清的oD值为 0．8左右 ，阴性参考血清 oD值小于 0．1的包被抗原稀释度作为最适 收稿 日期 ：2005—0406 基金项 目：国家 自然科学基金资助项 目；河南省科