农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究.pdfVIP

甘肃农业科技 　2004 年 　第 9 期 　　　Gansu A gr. Sci . and Techn . 　N o. 9 　2004 11 农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究 张 　宁 , 王 　蒂 (甘肃农业大学农学院 , 甘肃 兰州 　730070) 　　摘要 : 通过对农杆菌介导的烟草遗传转化方法进行优化 ,建立了一种快速高效的烟草叶盘遗传转化体系 。 用 OD600 为 0 . 5 的农杆菌悬浮液侵染大小约 1 cm ×1 cm 烟草叶盘 6～9 min ,然后置于以MS 为基本培养基附加 2 . 25 mg/ L 6BA 和 0 . 3 mg/ L NAA 的分化培养基上 ,在 100 mg/ L 卡那霉素选择压下 ,2128 d 可获得抗性不定芽 。通过卡 那霉素生根筛选和 PCR 扩增鉴定 ,其阳性转基因植株频率可达 57 . 1 % 。 　　关键词 : 烟草 ; 农杆菌 ; 叶片 ; 遗传转化 ; PCR 鉴定 ( ) 　　中图分类号 : Q78 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 2004 　　随着分子生物学和基因工程的飞速发展 ,在许 养 ,每 30 d 继代繁殖一次 。 ( 多未知基因功能的鉴定 、基因的各种调控元件如顺 1. 1. 2 　农杆菌菌株和质粒 　试验用根癌农杆菌 A 式调控元件 、反式作用因子等机理的研究中 ,烟草往 grobacterium tumef aciens) 菌株为LBA4404 ,含植物表达 往被作为转基因的模式受体植物 。在植物基因工程 载体 pBI12 1 ,其结构如图 1 ,抗性标记为 Km , 由载体 中 , 目前研究最清楚、应用最广泛的外源基因转化方 上的 np t II 基因编码 。 ( ) 法便是根癌农杆菌 A grobacterium tumef aciens 介导的 遗传转化技术 。在已获得的近 200 种转基因植物中 约有 80 %是由农杆菌介导完成的[ 1] 。近年来 ,这种 纯生物 的方法 由于具有转化率高 , 可导入大片段 图 1 　表达载体 pBI121 的 TDNA 结构 DNA ,且导入基因的拷贝数低 ,表达效果好 ,仪器和 操作技术较简单等优点 ,引起了人们的极大关注[2 ] 。 1. 1. 3 　酶和试剂 　Taq DNA 聚合酶购 自上海生物 该实验旨在建立农杆菌介导的高效快速的烟草遗传 ( ) 工程 Sangon 公司 , PCR 引物 由 Sangon 公司合成 。 转化技术体系 ,为分子生物学和植物基因工程的研 ( ) ( ) 利福平 Rif 和卡那霉素 Km 为 Sigma 公司产品 ,羧 究提供较好的技术基础 。