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卵巢肿瘤组织中nm23的表达和突变与其浸润转移的关系 肿瘤 1999年第4期第19卷 医疗研究 作者：李 力　张洁清　赵仁峰　姚德生　唐步坚　何靖育　陈心秋　古明华 单位：李力　张洁清　姚德生　唐步坚　陈心秋　古明华　广西医科大学附属肿瘤医院妇科(南宁 530021)；赵仁峰　何靖育　广西自治区人民医院妇产科 关键词：卵巢肿瘤；基因表达；肿瘤转移；聚合酶链反应；基因，nm23 　　??卵巢癌极易在早期发生浸润和转移，是导致初诊时70%已为晚期病人，60%的患者在首次手术时肿块直径超过10 cm，并且有转移灶的重要原因［1］。nm23基因是近年来分离鉴定的一种与抑制肿瘤转移相关的基因［2］。为了探讨nm23基因的高表达与卵巢肿瘤浸润转移的关系，作者采用RNA聚合酶链反应(RT-PCR)以及多聚酶链反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)对41例卵巢癌，20例卵巢良性肿瘤和21例正常对照组织中的nm23基因高表达以及突变进行检测。现将结果报告如下。? 　　材料与方法 　　一、研究对象 全部标本均取自本科和广西自治区人民医院1996年3月～1997年5月住院患者的手术切除标本，并经病理学检查确诊。分为(1)卵巢恶性肿瘤组，共41例其中上皮性肿瘤33例(粘液性癌10例，浆液性癌11例，内膜样癌2例，低分化腺癌10例)，非上皮性肿瘤8例(内胚窦瘤3例，无性细胞瘤2例，颗粒细胞瘤，未成熟畸胎瘤，睾丸母细胞瘤各1例)。临床分期按FIGO标准(1988年)，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期4例，Ⅲ期22例，Ⅳ期3例。全部病例均接受手术加术后规则化疗，随访最短6个月，最长20个月，疗效评定按WHO四级评定标准［3］。(2)卵巢良性肿瘤组，共20例，其中粘液性瘤6例，浆液性瘤8例，良性畸胎瘤6例。(3)正常卵巢组，共21例均来自子宫肌瘤手术同时行卵巢切除，病理学检查正常者。 　　二、组织标本收集及处理 全部标本均在手术时收集，除一部分作常规组织病理学检查外，其余立即放入液氮中保存待检。恶性肿瘤除在原发灶取材外，其中23例同时在癌旁和转移灶取材。 　　三、nm23表达的检测方法 1.组织总RNA的提取和cDNA的合成：组织中总RNA的提取采用酸性异硫氰酸胍一步法［4］。提取的总RNA加适量经二乙基焦酸盐(DEPC)处理的去离子水溶解，取其中10 μl经1.0%琼脂糖电泳鉴定及紫外分光光度计定量，计算吸光度A260/A280比值，检测RNA纯度，比值均大于1.80。取1 μg总RNA合成cDNA。逆转录cDNA试剂盒由Promega公司提供，按说明书操作。2.PCR扩增：(1)寡核苷酸引物制备，引物的设计参考文献［5］。由中科院上海生物工程研究中心合成，具体序列如下： 　　nm23-H1：5′-GCAGCCGCAGTTCAAACCTAA-3′ 　　3′-GCTGGGAGGAAGCATTTTAATCA-5′ 　　nm23-H2：5′-CACCTTCATCGCCATCAAGCCG-3′ 　　3′-CCACCTCTTATTCATAGACACC-5′ 　　nm23-H1及H2引物扩增DNA目的片段分别为685和475bp。(2)PCR扩增反应：取4 μl(100 ng)反转录cDNA作PCR扩增，总反应体积20 μl。含25 mmol/L MgCl2；10× PCR Buffer；10 mmol/L dNTPs；2u Taq DNA聚合酶；nm23-H1引物1.2 pmol，nm23-H2引物0.7 pmol。PCR扩增反应采用三阶温控法，nm23-H1为：94℃变性60s、56 ℃复性60 s，72℃延伸90 s，经33个循环后，72 ℃延长5 min。nm23-H2：94℃变性60 s，55 ℃复性60 s，72 ℃延伸90 s，经30个循环后，72 ℃延长5 min。(3)PCR产物电泳，采用非变性聚丙烯凝胶(PAG)电泳，方法参考文献［6］。3. PCR结果判断：PCR扩增产物经电泳分离后，以PCR-Marker分子量参照物(华美和物工程公司提供)对比碱基对大小。以出现明显的与目的基因碱基相同的区带(nm23-H1为685 bp，nm23-H2为475 bp)为阳性，见图1和2。 图1 nm23-H1基因RT-PCR结果 1：为PCR-marker分子量；2：阴性对照；3：正常组 　　4，5：恶性肿瘤；6：良性肿瘤 图2 nm23-H2基因RT-PCR结果 1：为PCR-marker分子量；2：阴性对照；3，4：恶性肿瘤 　　5：良性肿瘤；6：正常组织 　　四、nm23突变的检测方法 采用PCR-SSCP法，方法参考文献［6，7］。用0.1%硝酸银染胶，显带后立即拍照观察，见图3。 图3 nm23-H1基因PCR-SSCP银染结果? 1：为PCR-ma