反相高效液相色谱与质谱联用分析合成七肽的消旋产物.docVIP

反相高效液相色谱与质谱联用分析合成七肽的消旋产物 【关键词】 高效液相色谱 摘要 采用反相高效液相色谱（RPHPLC）与质谱（MS）联用技术对固相法化学合成七肽（H2NPFNSLAICOOH，Mr 760.9）时出现的消旋产物进行了分析。根据弱疏水性合成七肽粗品特性，提出了充分利用吸附和分配双重保留机制的“早期吸附”概念，以此优化色谱条件得到4个峰形良好的色谱峰；质谱分析表明：4谱峰具有相同的m/z 761.5 [M＋H]+值，对每一消旋产物进行在线多肽测序，并利用串联质谱（MSn）谱图叠加的方法，得到b轴和y轴两套片段信息，成功确定了合成七肽的4个消旋产物。 关键词 高效液相色谱质谱，固相多肽合成，消旋，多肽测序 1 引言 1963年Merrifield创建了固相多肽合成，用简单的洗涤操作代替了经典合成方式中的分离、重结晶、板层和柱层等纯化操作，其优越性使该方法广泛用于各种模式多肽和天然多肽的制备。但产物消旋是合成中普遍存在的现象，即原料氨基酸为L型（或D型），而产物中某些氨基酸残基会转变为D型（或L型）[1]，从而影响终产品纯度与收率。因此，防止消旋化成为多肽合成中一个十分重要的问题，而消旋产物的检测与分析是其中的关键。 RPHPLC具有极高的分辨率，已广泛应用于多肽和蛋白的分离。由于多肽在疏水性固定相表面上的吸附与解吸不仅取决于氨基酸序列，而且与其空间结构有关，即“疏水脚”的细微差别将使构象不同的多肽具有不同的色谱保留行为[2]。因此，RPHPLC可有效分离序列几乎完全相同的多肽及多肽的消旋化产物[ 3～5]。 本研究对采用HBTU/Fmoc固相法[6]化学合成弱疏水性七肽（H2NPFNSLAICOOH）时出现的消旋产物进行了RPHPLC/MS分析：基于适用于不同分离对象的塔板理论[7]、Onoff理论[8]和计量置换理论[9]等已有RPHPLC保留机理，根据弱疏水性多肽特性 ，提出“早期吸附”概念，并经色谱条件优化，得到了峰形良好的谱峰。通过将不同MSn条件下所得离子碎片和丰度信息进行选择性叠加[10]，实现了对每一多肽的一级测序，由此成功分析了合成七肽的4个消旋产物，为消旋化检测提供了一种新方法。 2 实验部分 2.1 仪器和试剂 高效液相色谱系统(大连依利特分析仪器有限公司),包括P200Ⅱ型高压恒流泵、UV200Ⅱ紫外可变波长检测器和Echrom98色谱工作站。色谱柱：Lichrosorb RP18, 粒径5 μm, 填料孔径10 nm, 200 mm×4.6 mm（美国惠普公司）；Lichrospher 100 C18, 粒径5 μm, 填料孔径10 nm, 250 mm×4 mm（德国Merck公司）;液/质联用仪：电喷雾离子阱质谱LCQ Advantage MAX，Bioworks 3.0数据处理软件（美国Thermo Finnigan公司）。七肽按文献[11]采用固相法手工合成；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；三氟乙酸（TFA）（色谱纯，迪马公司）；超纯水（自制）。 2.2 色谱条件 流动相：A液：水（0.1％TFA）；B液：乙腈（0.1％TFA）。最优梯度洗脱模式：0→10 min，B液0→7%；10→14 min，B液7％→30%；14→48 min，B液30％→50%。柱温：室温；流速：0.7 mL/min；检测波长214 nm；样品用60%乙腈/水溶解，浓度5 g/L；进样量20 μL。 2.3 质谱分析 色谱条件同上。电喷雾电离（ESI），正离子检测，碰撞气为氦气，雾化气（N2）流速5 μＬ/min，源温200℃，雾化压力0.345 MPa；扫描范围：50～2000 m/z。第一次质谱分析采用全扫描，以获得每个色谱峰准确且单一的m/z值，随后的质谱分析中改变相对碰撞能量等参数以获得一系列MS2图谱来完成多肽测序，采用Bioworks 3.0软件分析碎片信息，按文献[10]方法进行谱图的叠合解析。 3 结果与讨论 3.1 合成七肽粗品的质谱直接进样分析 对合成七肽粗品用质谱注射泵直接进样进行全扫描分析，得到单一的m/z 761.5 [M＋H]+ 峰，与目标多肽分子量760.9吻合，说明合成产物纯度很高，并未生成大量断头肽和空心肽之类的杂质。 3.2 合成七肽粗品的RPHPLC分析 3.2.1 弱疏水性多肽RPHPLC保留行为解析 RPHPLC中溶质保留机理的预测一直是色谱理论研究的热点，迄今为止提出的模型多达10余种，应用较多的主要有：适用于小分子物质的塔板理论[7]、Snyder经验公式、溶解度参数模型、溶剂色效模型、疏溶剂化模型等[8]；而对于生物大分子而言，Onoff模型[9]、尤其是耿信笃提出的计量置换保留理论（SDTR）是目前公认的保留机理[8]。 基于吸附机制提出的Onof