生化试验教材实验七：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.pptVIP

SDS实验七 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 刘向华 南京医科大学 生化与分子生物学系 Nanjing medical university Department of biochemistry and molecular biology 一.实验目的 了解并掌握SDS的原理 和使用方法 二.实验原理 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE （Polyacrylamide gel electrophoresis）。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。 实验原理（续） SDS多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的浓缩胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同。浓缩胶具有浓缩效应，电泳时，样品在进入分离胶之前会压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。 实验原理（续） 三.操作步骤 制胶 试剂(ml) 10%分离胶 5%浓缩胶 ddH2O 6 5.5 30%储备胶 5 1.3 1.5M Tris-HCl 3.75 1M Tris-HCl 1 10% SDS 0.15 0.08 TEMED 30 μl 16 μl 10% AP 0.15 0.08(临用前加) 总体积 15 8 上样：取10μl处理后的样品加入样品孔中。 电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，浓缩胶电压100V，分离胶电压150V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。 染色：将胶取出，考马斯亮兰染色液染色15min。 脱色 Staking gel Separating gel