红笛鲷cd40基因克隆、表达及功能研究-cloning, expression and functional study of cd40 gene in red snapper.docx

红笛鲷CD40基因克隆、表达及功能分析摘要红笛鲷（Lutjanussanguineus）是我国及东南亚重要的海水经济鱼类，食用价值和经济价值极高。近年来，随着养殖密度的增加及养殖水体的恶化，导致多种病原菌的爆发，对红笛鲷养殖业造成了巨大的经济损失。CD40分子是肿瘤坏死因子受体（tumornecrosisfactorreceptor,TNFR）超家族成员，属于I型跨膜糖蛋白。CD40分子在B细胞的活化、分化、Ig的分泌及类型转换，T细胞的激发、定向分化，抗原呈递细胞的激发、分化及功能调节，以及参与信号传导等方面起关键作用。而CD40分子执行生物学效应的前提条件是，通过CD40与CD40配体（CD40L）结合后组成的共刺激途径来影响免疫应答。CD40与CD40L是体内炎症和免疫反应系统的一对共刺激因子，参与机体内的体液和细胞免疫反应。目前，对CD40基因在免疫系统应答中的作用研究主要集中在哺乳动物，在硬骨鱼中极为鲜见。为了研究外界病原菌感染红笛鲷过程中，CD40基因在宿主免疫应答系统中的作用机制，我们开展了红笛鲷非特异性免疫基因CD40的分子克隆、表达特征及功能研究。1.通过同源克隆及RACE技术，从红笛鲷头肾组织中成功克隆了CD40基因的cDNA全长，通过生物信息学软件分析，结果表明，红笛鲷CD40cDNA序列由2073个核苷酸组成，完整开放阅读框（ORF）为984bp，5?非编码区（5?-UTR）为69bp，3?非编码区（3?-UTR）为1020bp，编码327个氨基酸，预测分子量（MW）为36.28KDa，理论等电点（pI）为5.38。N端有30aa的信号肽序列，在200-222aa位置存在跨膜结构域。红笛鲷CD40基因比较保守，具有TNFR家族成员共有的半胱氨酸富含域。构建系统进化树分析显示：红笛鲷与点带石斑鱼（Epinephelusmalabaricus）的亲缘关系较近。2.利用半定量RT-PCR技术对红笛鲷CD40基因的组织分布状况进行分析，结果显示，CD40基因在红笛鲷各组织中均有表达，其中在脾脏、头肾、肝脏、鳃、脑、心脏、胃中表达量较高，而胸腺、肌肉、肠、皮肤中表达量较少。应用Real-TimePCR检测在哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）、polyI:C、LPS分别刺激红笛鲷和红笛鲷头肾细胞后，不同时间内CD40基因的表达变化。结果显示，红笛鲷分别经哈维氏弧菌、polyI:C刺激后，CD40在头肾、胸腺、脾脏、肝脏、肠、鳃、肌肉组织中的表达量均上调且表达模式相似。0~84h内，随免疫时间的延长，CD40基因的表达量在上述组织中达到峰值的时间不同。PolyI:C、LPS刺激红笛鲷头肾白细胞后，结果显示，CD40基因在细胞中表达量上调，在孵育细胞12h后达到峰值，且经LPS孵育后CD40的表达量高于polyI:C的孵育结果。3.构建原核表达重组质粒pET32-CD40、pET32-△CD40和pET32-△△CD40，分别表达CD40基因全长cDNA、去信号肽基因cDNA片段和胞外段基因cDNA片段，I通过优化表达体系，三个重组融合蛋白的最优表达条件分别是：37℃下，0.08mmol.L-1IPTG，OD600=0.4，诱导5h；37℃下，0.1mmol.L-1IPTG，OD600=0.6，诱导6h；37℃下，0.06mmol.L-1IPTG，OD600=0.6，诱导6h。均以包涵体形式存在。对pET32-△△CD40重组蛋白进行纯化，Westernblot分析发现CD40胞外段融合蛋白能够与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性结合，表明目的蛋白得以成功表达。通过对重组载体pET32-CD40、pET32-△CD40分别在最优条件诱导后发现，pET32-△CD40的表达量高于pET32-CD40。4.用纯化后的pET32-△△CD40重组蛋白，免疫小鼠，制备了高效特异的鼠抗红笛鲷CD40多克隆抗体。同时利用制备的多克隆抗体对红笛鲷胸腺、头肾及脾脏组织进行了免疫组织化学分析。结果显示，CD40主要分布于上述器官的淋巴细胞中。采用CD40抗血清进行体外抗体中和实验，结果表明，与对照组的阴性血清相比，CD40抗血清能够明显抑制淋巴细胞增殖，且TNF和IL-6的表达亦受到抑制。本研究对于阐明红笛鲷抗外界刺激免疫反应机制具有重要的科学意义，也为进一步研究CD40的功能和鱼类非特异性免疫机制奠定了理论基础。关键词：红笛鲷，CD40，基因克隆，荧光定量，免疫组化Cloning,ExpressionandFunctionalAnalysisofCD40inredsnapper,LutjanussanguineusAbstractRedSnapper(Lutjanussanguineus),oneofthemostimpor