红笛鲷lck和tdt基因的克隆及表达研究-cloning and expression of lck and tdt genes in red snapper.docx

红笛鲷lck和tdt基因的克隆及表达分析摘要鱼类T淋巴细胞酪氨酸激酶（Lymphocytecellkinase，LCK）和末端脱氧核糖核酸转移酶（Terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT）均是效应T细胞形成的必要因子，在T细胞介导的免疫应答中具有重要作用，对其编码基因在细菌诱导下的表达模式进行研究，有助于揭示鱼类抗菌免疫的分子机制。本研究通过同源克隆和RACE技术获得红笛鲷（Lutjanussanguineus）lck和tdt基因序列全长，并利用免疫组织化学技术及原位杂交技术对其定位进行验证分析。结果如下：1.lck和tdt基因全长的获得及序列分析：基因克隆获得lck基因cDNA序列全长为2279bp，完整开放阅读框（openreadingframe，ORF）为1506bp，编码501个氨基酸。预测分子量（MW）为57.4kDa，理论等电点（pI）为4.98。tdt基因cDNA序列全长为1710bp，ORF为1392bp，编码463个氨基酸。预测MW为52.6kDa，理论pI为6.66构建的系统进化树分析显示，红笛鲷lck和tdt分别与大菱鲆（Scophthalmusmaximus）和尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus）的相应基因亲缘关系较近。另外，PSORTII预测结果显示lck编码的蛋白主要分布于细胞质，几率为39.1%，tdt编码的蛋白主要分布于线粒体，几率为60.9%。2.lck和tdt基因不同组织差异表达分析：以β-actin基因为内参，应用Real-timePCR技术，对哈氏弧菌ZJ0706感染前后，红笛鲷lck和tdt在肝脏、头肾、脾脏、胸腺、小肠、肌肉、鳃丝、皮肤、心脏、中肾和脑共11个组织中的表达进行定量分析，结果如下：lck在感染前后都能在头肾、胸腺和脾脏中检测到相应mRNA的表达，且最大表达量都出现在诱导后36h；tdt在感染前后都能在头肾和胸腺中检测到相应mRNA的表达，且最大表达量都出现在诱导后48h。3.lck和tdt基因定位分析：采用免疫组织化学技术研究在蛋白水平上LCK和TdT的分布。利用pET-28a(+)和pET-32a(+)载体构建pET28-LCK和pET32-TdT原核表达质粒，获得LCK和TdT融合蛋白，并利用Westernblot技术检测蛋白表达的准确性并制备鼠抗LCK和TdT多克隆抗体。结果显示：LCK和TdT融合蛋白均可与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性结合，说明目的基因成功表达；通过ELISA检测显示LCK和TdT抗血清效价均达到1：30000以上；抗血清能与LCK和TdT融合蛋白发生特异性免疫反应；利用上述抗血清进行免疫组织化学分析，LCK蛋白主要分布于胸腺、头肾及脾脏器官的淋巴细胞中，TdT蛋白主要分布于头肾和胸腺器官的淋巴细胞。采用lck和tdt基因原位杂交技术研究LCK和TdT在mRNA水平的免疫器官的分布，结果显示，lckmRNA在头肾、脾脏和胸腺组织中的分布，且在胸腺中的信号I最强烈，tdtmRNA在头肾和胸腺组织中的分布,在胸腺中的信号最强烈。由此可见，两个基因mRNA和蛋白的表达一致。关键词：红笛鲷，lck和tdt，Real-TimePCR，原核表达，免疫组织化学，原位杂交CloningandExpressionAnalysisoflckandtdtGenesinRedSnapper,LutjanussanguineusAbstractLymphocytecellkinase(LCK)andTerminaldeoxynucleotidyltransferaseenzyme(TdT)offisharetheessentialfactorintheprocessoftheformationofeffectorTcells,IthasanimportantroleinTcellmediatedimmuneresponses,Itcanhelptorevealthemolecularmechanismsoffishanti-bacterialimmune,bystudiedtheexpressionpatternofthelckandtdtgenecodingsequencesintheprocessofbacterialinduced.HomologicalcloningandrapidamplicationofcDNAends(RACE)methodswereusedtogetthefull-lengthcDNAoflckandtdtgeneinLutjanussanguineus.Inordertoresearchfunctionsoflckandtdt,RT-PCR,insituhybridizat