红树林来源streptomyces sp.ouc6819中drimentines类化合物生物合成研究-study on biosynthesis of dri mentines compounds from mangrove sp. ouc 6819.docx

目录第一章 前言 11.1 链霉菌简介 11.2 天然产物及其应用 21.3 非核糖体肽类(NRPs)化合物31.3.1 通过改变单体的识别改造 NRPs51.3.2 通过改变单体数改造 NRPs61.3.3 通过修饰酶结构修饰 NRPs71.4 异戊二烯化生物碱类化合物 81.5 二酮哌嗪(Diketopiperazines,DKPs) 101.6 本课题研究目的和意义 12第二章 Streptomycessp.OUC6819 基因组文库的构建142.1 引言 142.2 实验材料 152.2.1 菌株与质粒 152.2.2 主要实验仪器 152.2.3 实验试剂 162.2.4 培养基与缓冲液配方 162.3 实验方法 192.3.1 菌种保藏 192.3.2 大肠杆菌质粒的快速提取 202.3.3 碱裂解法质粒提取步骤 202.3.4 质粒去 RNA 处理 202.3.5 链霉菌总 DNA 提取 212.3.6 载体的去磷酸化 21Streptomycessp.OUC6819 基因组 DNA 的纯化 21Streptomycessp.OUC6819 基因组 DNA 的部分酶切 222.3.9 载体 SuperCos1 的处理及与目的片段的连接 232.3.10 噬菌体体外包装 242.3.11 侵染宿主菌 242.3.12 基因组文库质量检测及保存 252.4 结果与分析 252.4.1 载体与基因组 DNA 的处理252.4.2 文库质量及随机性检测 262.5 本章小结 26第三章 Drimentines 生物合成基因簇的克隆与分析273.1 引言 273.2 实验材料 273.2.1 实验菌株与质粒 273.2.2 引物 283.3 实验方法 283.3.1 E.coli电转化感受态细胞的制备及转化283.3.2 链霉菌与大肠杆菌间的接合转移 293.3.3 发酵 303.3.4 PCR 303.3.5 胶回收目的片段(50bp-40kb) 313.3.6 PCR 产物纯化试剂盒(100bp-10kb) 323.3.7 加 A 反应 323.3.8 序列分析网站 333.4 结果与分析 333.4.1 Drimentines 基因簇的克隆 333.4.2 含有 gap 的 DNA 片段的亚克隆 343.4.3 Drimentines 生物合成基因簇的基因结构分析与注释 353.4.3 Drimentines 生物合成基因簇的鉴定 373.5 本章小结 39第四章 Drimentines 基因簇在天蓝色链霉菌中表达研究 404.1 引言 404.2 实验材料 404.2.1 实验菌株及质粒 404.2.3 引物 414.3 实验方法 414.4 结果与分析 414.4.1 Cos4 在天蓝色链霉菌中的表达 414.4.2 pHC2 在天蓝色链霉菌中的表达 434.4.3 pHC5 在天蓝色链霉菌中的表达 454.5 本章小结 47第五章DriM 的体外表达与产物酶学性质研究 485.1 引言 485.2 实验材料 485.2.1 菌株及质粒 485.2.2 缓冲液 485.2.3 引物 495.3 方法 505.3.1 目的基因的扩增及载体的处理 505.3.2 酶的表达 515.3.3 酶的纯化 515.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 525.3.5 蛋白浓度测定 535.3.6 酶催化活性的检测 535.4 结果与分析 54pET28a::driM重组质粒构建 54DriM 的表达 55DriM 的催化活性 565.5 讨论 60第六章 总结与展望 616.1 本研究工作总结 616.2 主要创新点 616.3 Drimentines 生物合成研究工作展望 62参考文献 63致谢 68第一章 前言1.1 链霉菌简介链霉菌( Streptomyces)是一类生长在土壤、沼泽或海洋环境中，具有复杂形 态分化的好氧革兰氏阳性菌，是放线菌中最大的菌属。已经有报道的链霉菌有超 过 500 种，其基因组 DNA 的 G-C 含量为 69~78%。链霉菌能够产生丰富的次级 代谢产物，陆生放线菌一直是临床药物和工业上应用酶的重要来源，目前已有报 导的微生物来源的生物活性物质，有 60%以上是由放线菌产生的[1]，来源于链霉 菌的抗生素占所有抗生素的 52%，包括抗生素如链霉素、新霉素、四环素和氯霉 素等，因此，链霉菌是药物合成的天然宝库。链霉菌基因组中存在众多的负责次 级代谢物生物合成的基因簇，对第一个天蓝色链霉菌 A3(2)的全基因组序列分析 表明，可能有 20 个以上的基因簇负责次级代谢，大量基因参与调控、转运、