集成化微流控芯片的研制及其在大肠埃希菌o157h7检测中的应用-development of integrated microfluidic chip and its application in detection of escherichia coli o157h7.docx

摘要搭建了一套集成化微流控芯片自动化反应系统。该系统通过微阀控制器即可简单、快速、便捷地同时控制微流控芯片内11条通道的开关。2、在反应条件为：5%硫醇在60℃下反应1h，2mg/mL马来酰胺室温下反应30min时，玻片上的固定蛋白荧光信号最强；在反应条件为：1mg/mL链霉亲和素（SA）在室温下反应1h，10ug/mL生物素修饰的捕获抗体室温下固定30min时，玻片上的固定抗体荧光信号最强，细菌捕获率最高。3、在反应条件为：进样速度及时间分别为1μL/min和30min，检测抗体浓度及反应时间分别为50ug/mL和30min时，基于集成化微流控芯片系统检测大肠埃希菌O157：H7的检测通量为10样本/次，总检测时间和试剂耗量为1h和5μL，对大肠埃希菌O157：H7的最低检测限为1.6×103CFU/mL，与大肠埃希菌ATCC25922及伤寒沙门菌ATCC14028无交叉反应，批内精密度为5.2%。将本法初步应用于矿泉水、牛奶及粪便悬液模拟污染样品中大肠埃希菌O157：H7的测定，检测敏感度分别为92%、78%和62%，检测特异度均为100%，与培养金标法的总体符合率均80%，Kappa值显示本方法与金标法一致性较好。结论1、通过多层软光刻工艺可制作高度集成的微流控芯片；通过组装单片机和电磁阀可制作专用的芯片控制器；基于集成化微流控芯片自动化反应系统可实现并行高通量运行及流体操作的自动化，具有很好的可行性和灵活的操作性。2、巯基-马来酰亚胺基团硅烷化法固定蛋白质的效率比物理吸附法、氨基硅烷化法及环氧基硅烷化法更高；链霉亲和素亲和固定方法保持抗体活性的能力比蛋白G亲和固定法更高；因此，巯基-马来酰亚胺基团硅烷化-链霉亲和素法更适用于微流控芯片内抗体的固定。3、成功建立了基于集成化微流控芯片系统的大肠埃希菌O157：H7检测方法，与常规的细菌检测方法相比，此方法具有检测通量高、成本低、速度快、自动化程度高等优点，具有一定的研究发展和实际应用价值。关键词：微流控芯片；集成化；大肠埃希菌O157：H7；快速检测；高通量IIIABSTRACTObjective:E.coliO157:H7isacommonpathogenicbacteria,whichcancausehumanhemorrhagicdiarrheaandothersseriousillness,sotherapiddetectionofE.coliO157:H7hasimportantclinicalsignificance.Inrecentyears,themicrofluidicchiptechnologygaingreatinterestinginrapiddetectionofbacteriaasithasalotofadvantages,includingshortanalysistime,smallreagentconsumption,andeasytominiaturization,etc.However,themostrecentpathogenrapiddetectionmicrofluidicchiparestillsufferfromlowdetectionthroughput,andthecostofasinglesampletestingisstillrelativelyhigh.Inordertosolvethisproblem,thisstudyproposedintroducemicrovalveandmicrochannellarge-scaleintegrationtechnologyinpathogendetectionmicrofluidicchiptoachievehighthroughput,automaticallycontrolofE.coliO157:H7rapiddetectionbyusingintegratedmicrofluidicchipoperationparallelism.Methods:Developedautomaticintegratedmicrofluidicchipreactionsystem:usingautoCADsoftwaretodesigntheCADimageofintegratedmicrofluidicchip,whichhavemulti-channelsandmultiplesetsofpneumaticvalve.ThenmakingtheintegratedPDMSmicrofluidicchipbymoldingandmultilayersoftlithography.Assemblingadedicatedmicrovalvecontrollerwithsingle