脊尾白虾高血糖激素家族基因的克隆 表达及功能研究-cloning, expression and functional study of hyperglycemic hormone family gene in brachionus carinicauda.docx

摘 要 摘 要 为研究脊尾白虾蜕皮抑制激素基因(mih)在卵巢和幼体发育中的作用，本文采用 RACE 技术从蜕皮间期脊尾白虾眼柄中克隆获得 MIH-like 基因全长 1218bp 的 cDNA 序列，开放 阅读框编码 120 个氨基酸，包括 41 个氨基酸组成的信号肽和 79 个氨基酸组成的成熟肽， 同源性比较分析发现，脊尾白虾 MIH-like 基因与日本沼虾和罗氏沼虾同源性最高，分别为 87%和 86%。荧光定量 PCR 分析结果表明，脊尾白虾 MIH-like 基因在眼柄中的表达量最 高，在卵巢中的表达量最少，而在肝脏、肌肉、鳃和血细胞中不表达。该基因在脊尾白虾 卵巢发育的各个时期均有表达，随着卵巢的发育，Ⅲ期时 mih 基因的表达量极显著低于其 它时期(P0.01)，IV 期时 mih 基因的表达量显著升高。mih 基因在脊尾白虾溞状幼体发育 各个阶段均有表达，溞状幼体Ⅰ期 mih 的表达量极显著高于其他各期(P0.01)，溞状幼体 V 期 mih 的表达量下降到最低值；研究结果表明，mih 基因能够抑制脊尾白虾卵巢发育，且 参与了幼体蜕皮生长的调控。 为研究脊尾白虾性腺抑制激素基因(gih)在卵巢和幼体发育中的作用，本文采用 RACE 技术克隆获得脊尾白虾性腺抑制激素基因(GIH) cDNA 全长 1009bp 的 cDNA 蜕皮间期序 列，命名为 gih 基因。开放阅读框编码 111 个氨基酸，由信号肽(32 个氨基酸)和成熟肽(79 个氨基酸)组成。同源性比较和系统进化树分析：gih 基因与热液口虾同源性最高为 81%， 且与热液口虾紧密聚为一支。Real-time PCR 分析结果表明：gih 基因在眼柄中的表达量最 高，其次为腹神经节，在血细胞中的表达量最少，而在肝脏、表皮、肌肉和鳃中不表达； 该基因在脊尾白虾卵巢发育的各个时期均有表达，随着卵巢的发育，Ⅲ期时 gih 基因的表 达量极显著低于其它时期(P0.01)，IV 期时 gih 基因的表达量显著升高。gih 基因在脊尾白 虾溞状幼体发育各个阶段均有表达，其总体呈现升高、下降、再升高的趋势，溞状幼体Ⅵ 期 gih 基因的表达量下降并且达到最低值；在仔虾第一天和第三天 gih 基因表达量极显著 高于幼体其它各期(P0.01)。研究结果表明，gih 基因能够抑制脊尾白虾卵巢发育，且参与 了幼体蜕皮生长的调控。 为研究脊尾白虾高血糖激素基因(chh)在卵巢和幼体发育中的作用，本研究克隆获得的 脊尾白虾 chh 全长 710bp 的 cDNA 序列，开放阅读框编码 142 个氨基酸，由信号肽(割位点 在 Ala 和 Trp 之间，由 27 个氨基酸组成)、成熟肽(74 个氨基酸)和前体相关肽(33 个氨基酸) 组成。其二盐基切割位点为 KR，成熟肽第 12 位上没有 CHH 家族Ⅱ型肽中所特有的 Gly 残基，chh 基因与日本沼虾和罗氏沼虾的 chh 同源性最高，分别为 82%和 81%，且与日本 沼虾紧密聚为一支。脊尾白虾 chh 成熟肽 C-端为 GK，由此确定为脊尾白虾的 ES 型 CHH 基因。Real-time PCR 分析结果表明: chh 基因在眼柄中的表达量最高，其次为腹神经节， 在血细胞中的表达量最少，Real-time PCR 分析结果表明：chh 基因在眼柄中的表达量最高， 其次为腹神经节，在血细胞中的表达量最少，该基因在脊尾白虾幼体生长各个阶段均有表 I 脊尾白虾高血糖激素家族基因的克隆、表达及功能研究 达，溞状幼体在Ⅵ期 chh 的表达量极显著高于其他各期，溞状幼体生长到第Ⅳ期 chh 基因 表达量极显著低于其他各期。幼体Ⅰ期到Ⅴ期 chh 基因的表达量低于仔虾。chh 在脊尾白 虾卵巢发育的各个阶段均有表达，随着卵巢的发育，chh 的表达量在卵巢发育中后期时极 显著高于其它时期，在成熟期时 chh 的表达量显著下降。研究结果表明，chh 基因能够促 进脊尾白虾卵巢发育，且参与了幼体蜕皮生长的调控。 pH、盐度、氨氮是影响海水养殖虾蟹类生理生态的重要环境因子，可直接影响水生生 物的存活、生长、蜕皮、繁殖和免疫活性。本研究发现，环境胁迫后该基因具有明显的时 序性。pH6.5 胁迫后 24h 和 48h，眼柄和腹神经节中 MIH-like 基因的表达量较对照组均显 著增加(P0.05)；4mg/L 氨氮浓度组胁迫后 12h 和 24h，眼柄和腹神经节中 MIH-like 基因 的表达量较对照组均显著增加(P0.05)；盐度 39 胁迫后 12h 和 24h，眼柄和腹神经节中 MIH-like 基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05)，本研究结果表明脊尾白虾 MIH 基因 参与了环境胁迫后的机体应激反应。 关键词：脊尾白虾；高血糖激素