结缔组织生长因子对体外培养兔关节软骨细胞增殖和表型影响.pdfVIP

硕士学位论文 第一章材料与方法 前言 关节软骨是滑膜关节赖以发挥其传导负荷、运动功能必不可少的组成部分， 其丰富的II型胶原和蛋白多糖基质为关节运动提供了一个低摩擦力且光滑耐磨 的表面，可完成传导载荷，润滑关节，吸收震荡等功能，是骨骼运动时关节光滑 灵活的保证。但创伤和退行性疾病往往导致其发生不可逆的改变。许多关节疾患 包括关节内骨折、炎症及各种退行性关节病均可引起关节软骨损伤。大多数学者 认为，受损的软骨在机械磨损、炎症因子和酶的多重破坏作用下会逐渐发展、扩 大，进一步退变，最终将影响到关节功能，出现关节疼痛，运动障碍，发展成为 骨关节炎(oA)“。1。有研究者统计，16％的膝外伤患者会继发早期骨关节病，而在 老年患者中退行性骨关节炎占有很高比例01。我国己经进入人口老龄化社会，关 节软骨损伤的修复问题更突显其重要性。 对骨关节炎的深入研究发现，oA发病中存在着软骨细胞数量减少和软骨基 质破坏，软骨的修复贯穿于骨关节炎的全过程，各种保护性因子在其中起着重要 的作用嘲。现已证明，转化生长因子一B(TGF-B)、骨形态发生蛋白(BMPs)、成 纤维细胞生长因子(FGFs)、胰岛素样生长因子(IGFs)等生长因子可以促进软骨 细胞增殖，维持软骨表型，并在软骨基质降解中抵抗分解代谢，对软骨具有保护 作用∽1。但目前实验中使用的细胞因子半衰期短，价格昂贵，其疗效和安全性 还不明确，距离临床应用还有一定距离。因此寻找理想的保护因子仍是人们不断 探索的目标。 新近的研究发现，处于生长期体外培养的兔软骨细胞可高水平地表达结缔组 织生长因子(CTGF)，而处于休眠期的软骨细胞和成骨细胞则几乎不表达。 Nishida嘲的研究也表明，CTGF在正常关节软骨细胞中低水平表达，在骨关节炎 的软骨细胞集落中则强烈表达，而集落的形成代表软骨细胞的增殖反应。因此我 们设想cTGF对软骨细胞的生物学行为可能有～定的影响，可能可以促进关节软 骨细胞增殖和软骨基质表达，修复受损的关节软骨。但对目前结缔组织生长因子 在骨科特别是软骨方面的研究尚处于起步阶段。国内在这方面的研究未见相关文 献报道。本实验采用兔关节软骨缅胞体外培养的方法。将结缔组织生长因子作用 于兔关节软骨细胞，运用MTT比色法及免疫细胞化学的方法，探讨结缔组织生长 因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型的影响，研究cTGF对软骨细胞增 殖作用的量效关系，为组织学方法修复关节软骨缺损，治疗骨关节炎提供实验依 据。 硕士学位论文 第一章材料与方法 第一章 材料与方法 1．1主要材料 1．1．1实验动物 2月龄新西兰大白兔1只，由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供。 1．1．2实验试剂 0．2 AB 型胶原多克隆抗体，S C免疫组化试剂盒(5％BsA封闭液，二抗，SABC)， DA B显色荆，苏木素，多聚赖氨酸(武汉博士德公司)，PBS(湘雅二医院中心 实验室配置) 1．1．3实验仪器 超净工作台(苏州净化设备有限公司)，CO。培养箱(ThermoForma公司，美国)， 倒置相差显微镜(Olimpus，日本)，台式离心机(EppendorfCentrifuge，德 4 国)，酶联免疫检测仪(LabsystemsDragon，WellwashMK2，芬兰，一40C一200C 冰箱容声牌，国产)，细胞计数板(上海医疗器械厂)，无菌手术器械(湘雅 二医院外科手术室)，摄像系统(湘雅二医院中心实验室)，96孔培养板，6孔培 养板，25cm培养瓶，微量加样器，无菌盖玻片，离心管， 1．2软骨标本取材 中南大学湘雅二医院实验动物中心提供的成年新西兰大白兔1只，雌雄不 限，体重2．5kg，耳缘静脉注射空气处死，备皮、消毒、铺无菌单，作右膝关节 内侧切口，依次切开皮肤、皮下，显露膝关节，仔细剔除周围软组织，依次切断 髌韧带、内侧副韧带、外侧副韧带、前后交叉韧带，获得完整的股骨远端、胫骨 近端的关节软骨。类似方法获取对侧膝关节，双髋关节及双肩关节软骨。 1．3软骨细胞原代及传代培养 将采集的兔关节软骨标本保存在PBS中(含青霉素lOOu／ml、链霉素100u／ m1)，离体后