(北医生物化学课件）重组DNA技术知识.ppt

重组DNA技术;第一节 概述 ;一、克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等 ;质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。;配伍末端（compatible end）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端 ; 2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA ; 2、转染（transfection）：将外源DNA导入真核细胞的过程 ;六、“表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达 ;第三节 重组DNA技术与分子医学的关系 ; 三、基因诊断; 1、基因治疗的方法 （分类）;概述;一、质粒的特点： 1、环状DNA，2kb～数百kb。 2、某些质粒可以重组到染色体中复制，形成附加体。; 松弛控制性质粒，拷贝数多，不受细胞内染色体控制。;质粒载体;The constructed plasmid pBR322 ;An example of an E. coli expression vector. ;噬菌体载体 ;其它类型载体 ;其它类型载体 ;一、限制----修复体系（restriction-modification system）;二、限制性内切酶分类：依据酶的组成、所需辅助因子及裂介方式分为三类;限制性核酸内切酶;酶识别序列结构呈二元旋转对称又叫作回文结构(palindrome);The interaction of EcoRI endo-nuclease with its target sequence. The dimeric enzyme (with its two subunits in gray and light blue) is shown bound to DNA. In the top view the DNA binding site is facing the viewer. In the bottom view the bound DNA is facing away from the viewer and is not visible. ;限制性核酸内切酶;（3）平头钝性末端：如Hpa I;;基因工程的基本步骤;基因工程的基本步骤;基因工程的基本步骤;基因工程的基本步骤;一、化学合成法;目的基因的获得;目的基因的获得;重组体构建;DNA片段A ;Complementary homopolymeric tails are added to the ends of the two fragments to be joined.;二、平端连接;重组体构建;两个技术：制备感受态细胞和导入方法。; 针对载体携有某些标志基因或目的基因的筛选方法，直接测定基因及表型。;【实例】M13载体含?-半乳糖苷酶N端序列，而突变株细菌中可表达?-半乳糖苷酶C端序列，只有在两者共同表达时，才有酶的活性。; 3、分子杂交法：用32p标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的重组DNA片段进行杂交，直接鉴定目的基因。;重组子的筛选;重组子的筛选;【实例】脆性x综???征（fragile x syndrome）：一种精神痴呆，研究发现细胞内有些DNA含脆性位点，并鉴定出含脆性位点DNA序列的特殊标志，但致病的分子机制不清楚，1991年用YAC克隆及分子杂交技术证明脆性位点是一个（CGG）n重复序列。正常人含6-54，病人高达数百个（?200）。重复序列的增多使所在基因FMR-1不能转录出正确的mRNA，受累者出现综合征。;基因工程的应用;基因工程产品;A tobacco plant in which the gene for firefly luciferase is expressed. Light was produced after the plant was watered with a solution containing luciferin, the substrate for this lightproducing enzyme (see Box 13-3, Fig. 2). Dont expect glow-in-the-dark ornamental plants at your local nursery anytime soon; the light is actually quite weak and this photograph represents a 24 hour exposure. The real point-that this technology allows the introduction of new traits into plants-is nevertheless eleg