htert基因修饰的椎间盘髓核细胞永生化分析及干细胞样髓核细胞的分离鉴定-immortalization analysis of htert gene modified intervertebral disc nucleus pulposus cells and isolation and identification of stem cell-like nucleus pulposus cells.docx

山西医 山西医科大学博士学位论文 IV IV 胞的 CD105、CD29 和 CD44 三个抗体表达检测均为阳性，但是 NP-MSC 这三个抗体的平 均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）都比 BMSC 弱，其余阴性抗体（CD34、 CD45、CD14 和 HLA-DR）二者表达均为阴性。 在诱导成骨分化过程中未观察到两种干细胞的明显区别，均可在诱导 14 天-18 天观察 到成骨钙结节。在诱导软骨分化过程中发现，收集相同细胞数形成的细胞沉淀，在诱导 3-6 天时即发现 NP-MSC 形成了软骨样圆形小球，而 BMSC 在 12 天以后逐渐开始形成圆球状。 二者可能在软骨诱导方面有差异。成脂诱导观察：BMSC 在普通倒置显微镜下观察到脂滴 形成的时间很短，8 天左右不须染色即可观察到明显的脂滴，而 NP-MSC 在 12 天时观察仍 不十分清楚，诱导 16 天以上通过染色可以看到有脂滴形成，但是发现形成脂滴的细胞很 快死亡崩解（图 4-7），说明该细胞在成脂诱导过程中成活力比 BMSC 差。 结 论: 1. 成功构建了 hTERT 基因慢病毒表达载体 pGC-FU-hTERT，以 293T 为包装细胞，得到 了浓缩的高滴度慢病毒 Lenti-hTERT。 2. 慢病毒 Lenti-hTERT 可以成功感染髓核细胞并表达端粒酶，修饰后的髓核细胞可以稳 定传代并仍具有髓核细胞的基本特性，得到的永生化髓核细胞可以作为髓核组织工程 学种子细胞。 3. 从椎间盘髓核组织中成功分离了干细胞样的细胞，并初步鉴定其具有干细胞特性。 4. 髓核组织中分离而来的多边形细胞与干细胞样细胞在形态、细胞表型、细胞外基质分 泌等方面有明显差异。说明髓核组织中可能既存在髓核细胞，又存在髓核组织干细胞； 5. 同一个体中髓核来源与骨髓来源干细胞可能在软骨分化和成脂分化方面存在差异。因 此髓核来源干细胞作为组织工程学研究的一种新的种子细胞可能在软骨诱导方面有较 大应用价值。 关键词：hTERT；慢病毒；髓核；间充质干细胞；组织工程；种子细胞 PAGE PAGE VI Abstract Approximately 70%-85% of individuals experiences low back pain (LBP) during their lifetime. LBP and subsequent disabilities are common. Intervertebral disc degeneration (IVDD) is considered a major source of LBP. IVD tissue is composed of three highly specialized parts: Cartilage End-plate(CEP)、Anulus Fibrosus(AF) and Nucleus Pulposus(NP). NP is the first changed structure during IVDD. In our body NP is the largest avascular tissue, and its cell number is limited, so it is difficult to restore function by itself. To date, most currently available surgical options for IVDD can not recover the normal function of IVD. Along with the establishing of IVD NP and AF cell culture technique in vitro, and the development of the study of IVD cells from different species and also the study of the cartilage tissue engineering, it has brought us a promising future for the function regeneration of NP. The NP tissue engineering has been a direction of biological treatment for IVDD. In the study of tissue engineering, the culture of the seed cells is essential. However, because of the s