il1β单克隆抗体在癫痫治疗中的价值-the value of il 1β monoclonal antibody in epilepsy treatment.docx

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于保密，在年解密后适用本授权书。不保密√。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日研究目的：中文摘要癫痫是神经科常见慢性疾病之一，其病理生理机制复杂。近年来癫痫与神经系统炎症反应及炎性介质的关系已成为研究热点，受到广泛关注。最新研究显示，包括IL-1β在内的多种炎性介质在癫痫患者及癫痫动物模型的脑组织中表达水平升高。深入研究发现IL-1β能提高神经元兴奋性、增加痫性发作可能性。本研究通过腹腔注射氯化锂、匹罗卡品建立癫痫模型，探索能否通过腹腔IL-1β单克隆抗体中和癫痫持续状态所导致IL-1β含量异常升高，观察白介素1β（IL-1β）单克隆抗体对癫痫持续状态诱导大鼠海马组织炎症反应的影响。研究方法：72只健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组（n=20）、癫痫模型组（模型组，n=26）、IL-1β单抗抗体治疗组（治疗组，n=26）。模型组和治疗组均采用氯化锂-匹罗卡品建立癫痫模型，对照组以相同液体量的生理盐水替代氯化锂、匹罗卡品。当模型组、治疗组大鼠痫性发作达到Racine分级的IV-V级发作且持续1小时后，腹腔注射溴化甲基阿托品和地西泮解除痫性发作。治疗组大鼠于癫痫发作30分钟、7天及14天后分别给予IL-1β单克隆抗体1ml(20ug?ml)腹腔注射，模型组和对照组则给予等量的生理盐水。模型组和治疗组分别于造模后72h、21d两个时间点随机取3只提取海马组织总蛋白，采用蛋白质印记法检测用药后72h、21d海马组织中IL-1β单克隆抗体的含量。各组大鼠于造模后72h随机取10只大鼠断头取脑、分离海马组织和进行腹主动脉抽血，用RT-PCR检测痫性发作72h后海马组织中IL-1β、NF-κBmRNA表达水平，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中S100B含量。各组于造模后21天，大鼠行心脏灌注固定，分离脑组织进行冰冻切片，行免疫荧光法检测海马区胶质细胞活化情况及行尼氏染色检测神经元凋亡情况。通过统计学分析比较IL-1β单克隆抗体对癫痫的干预是否有效。I研究结果：1.在注射匹罗卡品10~40min后，模型组大鼠开始出现排便排尿、口角流涎、双眼充血等外周胆碱能反应；继之出现面部抽动、行动刻板、平衡力下降、行走不稳等表现；最后出现癫痫发作的典型症状：阵发性出现咀嚼或牙关紧闭、颈项强直或全身肌肉僵硬、湿狗样抖动、四肢不自主抽搐或痉挛，最终出现全身强直-痉挛发作并失去平衡、跌倒。模型组造模成功率85.29%，死亡率10.34%（68只大鼠，58只成功建立癫痫模型，其中4只在注射匹罗卡品后24h内死亡，2只在癫痫发作后48h内死亡，10只未出现典型的癫痫发作）。2.模型组大鼠海马组织中仅检测到少量IL-1β抗体，考虑与抗体的交叉反应有关，治疗组中给药72h（3.797±0.021）、21d（3.584±0.024）后大鼠海马组织中IL-1β单克隆抗体的浓度明显高于模型组（1.278±0.019、1.351±0.010）。与标准浓度比较发现不同时间点治疗组中IL-1β单克隆抗体的浓度均3.00ugAb/g。结果提示：IL-1β单克隆抗体能够通过血脑屏障并能保持有效治疗浓度（3.00ugAb/g）。3.模型组IL-1β、NF-κB表达水平均高于对照组（均P0.01），治疗组IL-1β、NF-κB表达水平均低于模型组（均P0.01）。4.对照组血清中S100B蛋白水平较低，与模型组比较，治疗组血清中S100B蛋白水平明显下降（P0.01）。5.尼氏染色显示对照组CA1区、CA3区锥体细胞、神经元排列整齐，形态完整；模型组CA1区、CA3区有神经元脱失及变形、胶质细胞增生（与对照组比较，P0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠海马CA1区、CA3区锥体细胞、神经元缺失情况显著减轻（P0.01）。6.为进一步探讨IL-1β单克隆抗体对于胶质细胞增生的影响，观察造模后第21天海马区胶质细胞增生情况，利用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、Iba1抗体进行荧光双标。免疫荧光双标染色显示，正常对照组大鼠海马无胶质细胞异常增生，SE21天在海马CA3区表现为