接枝gma-ida聚合物的磁性微球的制备及其对酪氨酸酶的固定-preparation of magnetic microspheres grafted with gma - ida polymer and its immobilization on tyrosinase.docxVIP

1绪论自20世纪下半叶以来，众多研究者一直致力于开发不溶性固定化酶的多种应用。与游离酶相比，固定化酶具有以下五个优势：（1）在生物催化过程中，能够有效地被重复回收利用，并可对反应过程进行有效控制，从而降低工业生产成本；（2）稳定且可以重复使用的固定化酶分析器件在医疗及分析仪器中应用广泛；（3）作为选择性吸附剂纯化蛋白质或酶；（4）能够作为固相蛋白质化学研究的基础工具；（5）能够做为有效地控制蛋白质药物释放的微器件。酪氨酸酶在自然界中分布广泛，从哺乳动物、植物到微生物中均发现酪氨酸酶的存在。酪氨酸酶重要的生物功能是催化氧气氧化单酚，使其邻位羟基化，并生成邻苯二酚，接着进一步将邻苯二酚氧化为邻苯二醌。酪氨酸酶可应用于生物催化合成治疗帕金森症的药物L-多巴，还可以应用于工业废水的脱酚处理，也可应用于检测酚及其衍生物的酶电极的制备等。但是酪氨酸酶价格较贵，因此研究各种新型的、性能良好的、成本低廉的固定化酪氨酸酶成为了许多研究者关注的对象。1.1酪氨酸酶的结构与功能酪氨酸酶又称多酚氧化酶，广泛存在于动物，植物，真菌和细菌中，是生物体内合成黑色素的一种重要的代谢酶。不同来源的酪氨酸酶在氨基酸序列、分子大小等结构方面有差异，因此其糖基化与生理活性作用也有一些不同[1]。此外，不同来源的酪氨酸酶其催化性能也有些差异，例如大多数植物源酪氨酸酶既可以催化氧化单苯酚，也可以催化氧化邻位多羟基苯酚，但是甘薯源酪氨酸酶则只能催化氧化邻位多羟基苯酚，真菌中链霉菌属(Streptomyces)[2]及蘑菇属的酪氨酸酶，与细菌中青枯源酪氨酸酶则具有异常高的催化氧化邻位单苯酚的能力。Matoba[2]等采用定点突变技术及X射线技术等发现链霉菌属(Streptomyces)酪氨酸酶是含铜金属酶，并有两个铜离子活性中心，其中一个铜离子活性中心连结三个组氨酸残基与一个半胱氨酸残基，另外一个铜离子则连结四个组氨酸残基，但是Klabunde[3]等研究甘薯源酪氨酸酶结构过程中，发现两铜离子活性中心各自只连结三个组氨酸，研究者们推测酪氨酸酶对单苯酚的邻位羟基化作用可能与其中一个铜活性中心上多出的组氨酸残基有关，目前酪氨酸酶的详细的结构及催化机理还没有完全弄清楚。植物中的酪氨酸酶的催化特性与生物体物质的合成，着褐色反应，抵抗致病菌和食草动物等有关，真菌的酪氨酸酶则有与加强其致病性和自我保卫能力等有关，酪氨酸酶基本的生物催化反应如图1.1所示，在氧气的参与下，酪氨酸酶可以将多种取代的单苯酚类化合物，转化为邻位双羟基苯酚，接着将邻苯二酚类化合物氧化为醌，一些Dopa类邻苯二酚化合物不稳定，快速转变为邻位二醌，接着，邻位二醌则转变为Dopa色素。图1.1酪氨酸酶的催化功能[4]1.2固定化酪氨酸酶及其应用酶的固定化技术是现代生物技术及其工业化环节中的一个核心技术，是利用化学或者物理的方法，把游离酶束缚在非水溶性载体上，或者限制游离酶的自由流动，将其包裹在一定区域内，但酶仍能够充分发挥其生物催化作用的技术。与游离酶相比，固定化酶一般在操作稳定性、热稳定性、抗微生物降解性、贮存稳定性以及耐酸碱性方面有很大提高，而且能够简便地与反应体系分离，实现重复利用。由于固定化酪氨酸酶在L-Dopa类药物的生物催化合成[5]，含酚工业废水的处理[6]，酚类环境污染物的电化学分析[7]，果汁的澄清[8]等许多方面有重要的应用，国内外学者在此方面进行了较多的研究，下面将根据酪氨酸酶的不同固定化方法，对固定化酪氨酸酶的最新研究做一些综述。包埋法包埋法是将聚合物的单体和酶溶液混合后,再借助聚合促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的[9]。利用包埋的方法来固定酶的材料很多，诸如海藻酸钠[12]、壳聚糖[11]等天然高分子多糖类和聚丙烯酰胺[10]、聚乙烯醇等合成高分子化合物。Ates[12]等用铜离子代替钙离子作为交联剂，通过包埋法用海藻酸铜凝胶微球固定酪氨酸酶。他们将含有酪氨酸酶的海藻酸钠水溶液滴入CuCl2溶液中，所形成的海藻酸铜-酶凝胶微球经CuCl2溶液浸泡后，再用戊二醛使被包埋的酶再次酶交联，防止酶从凝胶网格中的泄露。由于海藻酸钠对二价铜离子的亲和性强于钙离子，因此海藻酸铜凝胶比海藻酸钙凝胶在机械强度与硬度方面得到了较高提高，因此该固定化酶的机械性能与稳定性也大大提高。他们将该固定化酶用于填充床反应器中L-Dopa的合成，其产量能够达到110mg/Lh。利用海藻酸钠形成的凝胶固定化酶的方法简便易行，但为了进一步提高此法的酶负载量，有学者对此方法进行了改进。Yahsi[10]等将包埋法与共价法相结合，采用海藻酸钙凝胶微球(Ca-alginate)分两次固定化酪氨酸酶，大大提高了酪氨酸酶的负载量及固定化酶的稳定性。他们将含有酪氨酸酶的海藻酸钠水溶液滴入CaCl2溶液中