结直肠癌血清比较蛋白质组学分析及特征多肽的功能分析-proteomic analysis of colorectal cancer serum comparison and functional analysis of characteristic polypeptides.docx

结直肠癌血清比较蛋白质组学研究及特征多肽的功能研究摘要本 实 验 室 前 期 利 用 Ciphergen 公 司 SELDI-TOF-MS （ surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）技术结合固相 表面层析蛋白芯片对多种肿瘤（包括内胚层来源的结直肠癌[1,2,20,21]、胃癌[3]、肝癌[4]、 食管癌[5]和肺癌[6]，以及乳腺癌[7]、卵巢癌[8]等）进行血清比较蛋白质组学研究，发 现 了 特 异 的 在 这 些 肿 瘤 中 高 表 达 的 标 志 物 ， 获 得 了 较 为 理 想 的 结 果 。 但 由 于 SELDI-TOF 不具备二级质谱而且分辨率不足以完成 PMF（肽指纹图谱，peptide mass fingerprinting，PMF），所以无法鉴定前期研究所发现的标志物，无从获知其序列信息， 无法对其功能进行深入的研究。本研究正是基于前期研究所积累的大量血清样本，采用 MALDI-TOF/TOF－MS（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization time of flight tandem mass spectrometry， MALDI-TOF/TOF-MS）串联质谱技术结合液相层析技术（IMAC 磁珠，Immobilized Metal ion Affinity Chromatography magnetic bead）对结直肠癌血清进行比较蛋白质组 学研究。自本实验保存的结直肠癌术前患者和正常人血清样品库中，随机抽取结直肠癌患 者和正常人各 30 例作为实验组和对照组，其中男女比例为 1:1，年龄范围 40-60 岁，中位年龄 53 和 51 岁。其中结直肠癌术前患者均经病理诊断确诊，其中 Dukes A 期 1 例，Dukes B、C 和 D 共 29 例。实验组和对照组有相似的暴露史，均排除影响血清 蛋白质含量的其他相关性疾病。随机抽取结直肠癌患者和正常人各 50 例作为双盲检 测组，用于结直肠癌标志物的验证。本研究采用多种生物统计学方法（遗传算法 Genetic Algorithm（GA）、快速分类法 Quick Classifier、支持向量机算法 Support Vector Machine（SVM）、监督神经网络算法 Supervised Neural Network algorithm（SNN）） 对 MALDI-TOF/TOF-MS 所获取的数据进行分析，结果发现 46 个蛋白质/多肽在结直 肠癌患者血清表达水平与正常人血清中的含量差异有统计学显著差异（P0.05）。同时用双盲检测对比多种算法建立的诊断模板，发现采用监督神经网络算法建立的模板 为最优模板。此算法采用的多肽数据较少，分组总准确率为 100%，双盲检测总准确 率为 100%，特异性为灵敏度均为 100%。并根据权重打分，确定 1466.9Da 在监督神 经网络模板中诊断价值最高。与前期 SELDI-TOF-MS 结合 IMAC 芯片对结直肠癌血清进行比较蛋白质组学的研究结果，发现并未见相同的模板。为评价其诊断结肠癌的价值，对其作接收者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC 曲线）， ROC 曲线下面积为 1，说明其诊断结直肠癌的价值极高，并且 1466.9Da 多肽在结直 肠癌血清中高表达，因此被本实验命名为结直肠癌特征多肽（Colorectal Cancer Characteristic Peptide，CCCP）。本研究采用 MALDI-TOF/TOF-MS 获取结直肠癌特征多肽的二级质谱图，在搜索 MASCOT 数据库无解的情况下，采用 DeNoVo 分析，依据多肽碎裂产生离子碎片的 规律，推断出结直肠癌特征多肽的氨基酸序列。随后并用 BlastP 软件搜索 GeneBank 上的非冗余蛋白质序列数据库，发现结直肠癌特征多肽位于人第 20 号染色体长臂上， 是活性氧调节因子 1（reactive oxygen species modulator 1，ROMO1）中的一段序列（第 42-53 位氨基酸）。活性氧调节因子 1 分子量与本实验室前期利用 SELDI 结合 IMAC 芯片技术发现的结直肠癌生物标志物一样，均为 8.9kD，但由于其氨基酸序列不明， 所以二者是否存在关联尚不清楚。本研究所发现的结直肠癌特征多肽为 ROMO1 中一 段序列，可能为 ROMO1 的代谢产物，也可能是 ROMO1 mRNA 选择性剪切的结果 而可能具有相应的功能。同时发现