蔗糖酶-酶工程实验.pdfVIP

【实验一】蔗糖酶的提取（实验分组：4 人） 1.实验学时：6； 2.实验目的：掌握蔗糖酶提取的流程。 3.实验内容：沉淀、透析，及活性测定。计算酶的提取效率。 4.实验要求：理解影响酶提取的基本原理，掌握沉淀、透析等方法、影响实验结果的重要因素、掌握 数据的分析方法。 一、实验原理： 1、蔗糖酶 酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种在细胞质内，前者活力较高，分子量较大（约 270KDa ），后者活力较低，分子量约为 135KDa，两种酶的底物专一性和动力学性质十分相似，因此，本 实验未区分内酶与外酶。 2 、蔗糖酶的初步分离纯化 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。 由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始 终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。 蛋白质在用有机溶剂沉淀分离后，需要将蛋白质中的有机溶剂除去，常用的办法是透析。透析机可以 除盐，又可以除杂蛋白，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透 析所需时间较长，所以最好在低温中进行。 3、蔗糖酶活性测定原理 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶 EC 3.2.1.26 ），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗 糖）的 1,2-糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解 1mol 蔗糖，就能生 成 2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉（Nelson-Smogyi ）试剂比色法，斐林 试剂法等。 本实验采用 3.5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是 3.5-二硝 基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正 比。因此可利用分光光度计在520nm 进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干 扰较小。 蔗糖酶活力单位(u)：蔗糖酶在室温(25℃）, pH4.5 的条件下，每分钟水解产生 1 μmol 葡萄糖所需的 酶量(ml) 。 蔗糖酶比活力的计算：每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg 蛋白质表示。酶 的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力 的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。 比活力——酶的总活力单位数除以总蛋白mg 数，即每 mg 蛋白所含有的酶活力单位数。 比活力＝活力单位/mg 蛋白 4 、蛋白质浓度测定原理： Bradford 法是基于考马斯亮蓝 G-250 有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下， 可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速稳定，反应化合物在 465～595nm 有最大的吸光值，化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。因此可检测 595nm 的光吸收值的大 小计算蛋白质的含量。 二、试剂和仪器 1、实验材料 （1）市售蔗糖酶， 95% 乙醇(-20℃）、透析袋；（2 ）5%蔗糖溶液 500ml；（3 ）20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 （4 ）0.2mol/L 乙酸缓冲液（pH 4.5 ）： A ：0.2mol/L NaAC ：称取27.616g NaAC 溶解并定容至 1000ml。 B ：0.2mol/L HAC ：100ml 乙酸(分析纯)定容至 500ml 。 将两者分别取 315ml、185ml 混合，用强碱调 pH 到 4.5 。 (5) 考马斯亮蓝 G-250 溶液（0.01% ）：称取0.1g 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml 95%乙醇中，再加入 100ml 浓磷酸（市售质量百分数为 85% ），然后加蒸馏水定容至 1000ml。 (6) 3,5-二硝基水杨酸试剂: 3.15 g DNS （3,5-二硝基水杨酸,化学纯）溶于 131 ml 2M NaOH热溶液中（10.48g NaOH溶于 131ml蒸馏水 中），加入250 ml酒石酸钾钠热溶液（91 g酒石酸钾钠溶于 250 ml蒸馏水中），再加 2.5 ml苯酚（固体加 热）和 2.5 g Na SO ，溶解后定容到 500 ml，贮于棕色瓶中 7 天后使用。 2 3 2、仪器： 电子天平（