分子生物学-15-2-测序技术知识.pptVIP

11.2 核酸测序Nucleic Acid Sequencing 郜刚 分子生物学讲义 山西师范大学生命科学学院 测序技术 有钱人的游戏 测序，测序： ABI377 自动测序仪 测序技术 ABI373 0xl 自动测序仪 测序技术 MegaBACE1000 自动测序仪 测序技术 DNA序列测定概述 1、定义 核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 　　 概述 测序的目的，2种： 1、确证性测序 突变 定位 鉴定（已知基因序列） 2、从头序列 （未知基因序列） 概述 3、测序的老方法 DNA序列测定常用方法有如下3种： 1、末端终止法 2、化学裂解法 3、加减法 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。 特异性引物在DNA聚合酶的作用下合成只差一个碱基的不同长度的寡聚核苷酸片段；在4个特定的反应体系中，寡聚核苷酸单链片段的合成终止于某一个特定的碱基 。在4个特定反应体系中，各个反应液中缺少一种脱氧核糖核苷三磷酸(减法)，或只加入一种脱氧核糖核苷酸(加法) 优点 简便、迅速、应用广泛。 不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。 但由于加减法测序精确度不高，所以没有得到广泛的应用 概述 测序技术的最近发展 概述 1、商品化测序试剂盒 解决了质粒问题，节省了时间，但缺乏灵活性。 2、自动化测序仪 以酶学测序反应或（和）放标测序产物为基础， 微机处理。 3、热循环测序 使极少数测序产物线性放大。 4、测序商品化 20-40元/反应 DNA序列测定的应用 概述 分析基因组核苷酸排列序列 分析基因序列 基因定点诱变的基础 基因工程载体构建中DNA序列定位和排序的基础 确定DNA序列中蛋白质的编码区 Sanger双脱氧末端终止法1977 一、原 理 （一）DNA复制的4个基本条件 1、ssDNA模板 2、DDDP （ DNA依赖的DNA聚合酶 ） 3、带有3’-OH末端的单链寡核苷酸引物 4、4种dNTP （二）链终止剂（chain-reminator）2，3-二脱氧核糖核酸酶 当3’-OH由于脱氧，下一个核苷酸不能通过5’磷酸形成3’-5’磷酸二酯键，使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。如果用相同的4组引物-模板混合物，每一组除了加4种dNTP之外，另外分别加1种用32P（或35S）标记的ddNTP，这样每组中的ddNTP与相应的dNTP竞争掺入新合成的链并且在这里终止，理论上凡是应该掺入这种dNTP的地方都会有ddNTP，将产生一系列的以ddNTP为末端的不同长度的链，经PAGE分离，即可读出被测定的全部顺序（关键是dNTP和ddNTP竞争结合底物）。 Sanger双脱氧末端终止法图解 Automated reading Fluorescent 对模板和酶的要求比较高 纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA都可以用作Sanger法测定的模板。模板的质量和所用的DNA聚合酶的种类是至关重要的。 一般不直接采用制备质粒DNA的方法来获得模板序列； 通常需要用CsCl-溴化乙锭梯度离心结果纯化质粒DNA； 耗费大量的人力和物力。 通常采用M13噬菌体载体法 插播内容 1、用噬菌体M13克隆待测DNA片段 1）噬菌体是寄生在细菌的病毒。存在3种状态，有尾20面体，无尾20面体和丝状单链噬菌体（filamentous），M13是一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体，含单链环状的DNA。它感染细菌（宿主菌）呈溶原状态生长，在菌体内形成过渡阶段双链环状复制型DNA（Replicative form DNA，RF DNA），在适当的条件下，可以扩增至数百个拷贝。 用M13作克隆载体，有1个得天独厚的优点，即可产生大量含有外源DNA其中1条链的DNA分子 插播内容 2）M13mp18和M13mp19载体 （1）mp系列载体特点： ①都是从同一重组M13mp1改造而来。 ②在基因II-IV（500bp，570bp左右）之间有1个多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）可供外源基因插入。 ③该区域（MC