利用crisprcas9系统构建mc3r基因敲除猪-construction of mc3r gene knockout pig by criscas 9 system.docxVIP

英文缩写英文全称中文名称批1C3RMelanocrtin- 3receptor黑素皮质素受体 3MC4RMelanocortin-4 receptor黑素皮质素受体 4MSHMelanocyte Stimulating Hormone黑细胞剌激激素MSTNMyostatin肌肉生长抑制素基因NHEJNon-homologous End Joining非同源末端连接ORFOpen reading 企ame开放阅读框PAMProto-spacer Adjacent Motifs保守序列PBSPhosphate Buffer Saline磷酸缓冲盐洛液PC2Pro-hormone Convertase 2激素原转化酶 2PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应POMCProopiomelanocortin前阿黑素细胞皮质激素PSPenicil1in-Streptomycin Solution青霉素.链霉素混合溶液PVAPolyvinyl alcohol聚乙烯醇PZM-3QTLPorcine 马rgote medium 3Quantitative trait locus胚胎培养液数量性状基因座RVDRepeat variable diresidues可变残基Transcription Activator-LikeEffector转录激活因子样效应物TALENsNuc1eases核酸酶TMsTransmembrane domins跨膜结构域Vf\征fVentromedial hypothalamus下丘脑腹内侧核VTAVentral tegmental area中脑腹侧被盖区ZFNsZinc Finger Nucleases辞指核酸酶II摘要黑素皮质素受体(Melanocortin Receptors，MCRs)是G．蛋白偶联受体， 迄今为止共发现五个成员，在黑素皮质素(Melanocortin，MC)刺激下，都能够 增加胞内cAMP的浓度，启动胞内信号。但是MCRs各成员间生理作用迥异， 其中MC3R基因在下丘脑中高表达，对控制动物食欲和调节能量平衡中发挥重 要作用：MC3R基因的突变与人类肥胖密切相关，被认为是代谢综合症相关的候 选基因；此外，猪的采食和能量分配对其生长速度、胴体瘦肉率等经济性状具 有重要影响，所以MC3R基因在猪的育种上也具有潜在的应用价值。但其确切 生理功能、作用机制还不清楚。基因敲除动物模型是确定一个基因生理功能的 最佳材料，但至今未见MC3R基因敲除猪模型的报道。与啮齿类动物模型相比， 猪的各项生理指标与人类更为接近，所以建立MC3R基因敲除模型猪不仅可以 用于明确MC3R的生理作用，为治疗肥胖综合症提供新的思路和方法，还可以 评估其在猪分子育种中的价值。本文采用新型基因组编辑技术CⅪSP刚Cas9系统，在中国实验用小型猪 (Chinese Experimental Mini pig，CEMP)MC3R基因起始密码子的上游12 bp、 终止密码子下游45 bp以及MC3R基因的CDS区起始密码子下游288 bp和终止 密码子上游6l bp设计四个MC3R基因敲除靶位点，构建MC3R—pX330基因敲 除载体并验证各载体的打靶效率。利用构建好的MC3R．pX330基因敲除载体， 通过电击法转染猪胎儿成纤维细胞，筛选获得具有G418抗性细胞共72个克隆， 经PCR验证，其中MC3R敲除纯合子克隆10个，杂合子克隆11个，阳性率达 到29．16％。以筛选得到的MC3R缺失细胞克隆为供体细胞，通过体细胞核移技术移植获得了MC3R基因敲除猪1头。本研究利用CRISPR／Cas9系统快速高效 的构建了MC3R基因敲除猪模型，为研究MC3R基因的生理作用和分子机制提 供了材料。关键词：MC3R；C砒SP刚Cas9；基因敲除：猪ⅢABSTRACTThe melanocortin receptors(MCRs)are a family of G protein—coupled receptors． So far．a totat of five members have been found．MCRs are activated bY melanocortin ligands and cascade the signals through increasing cAMP in the cells．Different members of MCRs were expressed in varietal cell types and played variance functions．MC3R gene high express in the hypothalamus，it was p