金叶败毒颗粒药物血清抗人巨细胞病毒感染的体外实验分析-experimental analysis on anti-human cytomegalovirus infection of jinyebaidu granule drug serum in vitro.docx

金叶败毒颗粒药物血清抗人巨细胞病毒感染的体外实验研究中文摘要【目的】通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）法分别检测金叶败毒颗粒药物血清抗人 巨细胞病毒（HCMV）感染吸附、穿入、复制三环节的活性，探讨金叶败毒颗粒抗 HCMV 感染的作用机制。【方法】1.细胞悬液法原代培养人胚肺成纤维细胞（Human embryonic lung fibroblast, HEL）。 2.HCMV AD169 毒株体外细胞培养法传毒增殖，Reed-Muench 法计算病毒半数细胞感染量 TCID50。3. 制备金叶败毒颗粒药物血清：①将正常成年雌性日本大耳白兔按体重随机分为低、中、高剂量组和空白对照组四组，每组 3 只；低、中、高剂量组给药量分别为 1.5g/Kg、3g/Kg、6g/Kg，相当于成人每次每公斤体重用药剂量的 5 倍、10 倍、20 倍，用温双蒸水 50ml 溶解药物，空白对照组给予等体积的双蒸水；②低、中、高 剂量组灌服相应剂量金叶败毒颗粒，空白对照组灌服等体积的双蒸水，每天上、 下午各一次，连续 3 天，第 4 天上午给药后 1h、1.5h、2h、2.5h、3h 于兔耳中央 动脉采血，血静置 2h,3000rpm 离心 20min,取上层淡黄色透明样血清，56℃水浴灭 活 30min，一次性滤器过滤除菌，-80℃低温冰箱保存备用；③使用前将所需剂量 的血清从-80℃取出，37℃水浴解冻，用细胞维持液将药物血清配置为 5%、10%、 20%、药物血清-DMEM 培养液。1×104.金叶败毒颗粒药物血清细胞毒性检测：将 HEL 细胞悬液以 5/ml 的密度接种于 96 孔培养板，37℃、5% CO2 培养箱培养 24 小时，用各组药物血清-DMEM 培 养液干预细胞，细胞病变法（Cytopathogenic Effect, CPE）观察细胞形态变化， MTT 法检测 OD 值，筛选出无细胞毒性的药物血清-DMEN 培养液。55.金叶败毒颗粒药物血清抗病毒活性检测：将 HEL 细胞悬液以 1×10/ml 的密度接种于 96 孔培养板，37℃、5% CO2 培养箱培养 24 小时，先后用 100TCID50/100ul的 HCMV AD169 株 100ul、筛选出的无细胞毒性的药物血清-DMEM 培养液干预细胞，CPE 法观察细胞形态变化，MTT 法检测 OD 值，计算病毒抑制率，筛选出 抗病毒活性最高的药物血清-DMEM 培养液。6.金叶败毒颗粒药物血清对 HCMV 吸附、穿入、复制影响的实验研究：将 HEL 细5胞悬液以 1×10/ml 的密度接种于 96 孔培养板，37℃、5% CO2 培养箱培养 24 小时，利用同步感染法（Synchronized infection assays），先后用 100TCID50/100ul 的HCMV AD169 株 100ul、抗病毒活性最高的药物血清-DMEM 培养液干预细胞， CPE 法观察细胞形态变化，MTT 法检测 OD 值，计算病毒抑制率，评价金叶败毒 颗粒药物血清抗 HCMV 感染吸附、穿入、复制三环节的活性。【结果】1. HCMV AD169 毒株半数细胞感染量为 10-3.4/100ul。2. 金叶败毒颗粒药物 血清细胞毒性检测：①低剂量组药物血清：分别在灌胃后 1h、1.5h、2h、2.5h、3h 采 血配置的 5%、10%药物血清-DMEM 培养液和 1h、1.5h 采血配置的 20%药物血清-DMEM 培养液无细胞毒性，与空白对照组药物血清比较差异无显著性意义（p＞0.1）。②中剂量组药物血清：分别在灌胃后 1h、1.5h、2h、2.5h、3h 采血配置的 5%、10% 药物血清-DMEM 培养液和 1h、1.5h 采血配置的 20%药物血清-DMEM 培养液无细胞 毒性，与空白对照组药物血清比较差异无显著性意义（p＞0.1）。③高剂量组药物血清： 分别在灌胃后 1h、1.5h、2h、2.5h、3h 采血配置的 5%、10%药物血清-DMEM 培养液 和 1h 采血配置的 20%药物血清-DMEM 培养液无细胞毒性，与空白对照组药物血清比 较差异无显著性意义（p＞0.1）。3. 金叶败毒颗粒药物血清抗病毒活性检测：①中、 高剂量组药物血清具有较高的抗 HCMV 作用，与病毒对照组比较差异有显著性意义（p＜0.01），中剂量组、1.5h、5%药物血清的病毒抑制率达 90.90%；②随时间变化， 药物血清的抗 HCMV 作用在 1.5h、2h 两个采血时相达到高峰，1.5h 与 2h 药物血清组 的抗 HCMV 作用相当，比较差异无显著性意义（p＞0.1）；③采血时相为 1.5h、2h 时， 中、高两种剂量组药物血清抗 HCMV 的作用相当，比较差异无显著性意义（p