抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-methicillin - resistant staphylococcus aureus.docx

摘 摘 要 摘 要 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin—resistant Staphylococcus aureus，MRSA） 是一种引起医院感染的多重耐药菌，具有毒性强、耐药广泛、易于传播等特点，MRSA 感染已被公认为世界最难解决的感染性疾病之一。目前，对于 MRSA 引起的疾病的 治疗仍然缺乏有效的药物，筛选具有抑制 MRSA 的候选化合物，对于开发由 MRSA 引起疾病的药物具有重要意义。 本课题在发现产抗菌物质的菌株具有抗 MRSA 作用的基础上，对其活性成分进 行以抗 MRSA 为导向的提取、分离纯化、初步稳定性与安全性评价以及含量测定， 获得如下研究成果： 1.从 246 株菌株中发现 5 株具有抑制 MRSA 活性的菌株，通过对优选菌株 1012-4 的形态观察和生理生化测定，并结合 API50 CHB 鉴定系统与 16S rDNA 序列测定， 该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。 2. 筛选出菌株 1012-4 的最佳发酵培养基为葡萄糖 20g/L，干酵母 5g/L，MgSO4 0.5g/L；筛选出种子培养基摇床培养条件为培养温度 37℃，接种量 3%（V/V），培养 时间 24h，装液量 200mL/500mL 瓶；优化了发酵罐发酵工艺，其技术参数为转数 150 r/min，通气量 30L/min，罐压 0.06MPa。 3.筛选出大孔吸附树脂提取菌株 1012-4 产抗 MRSA 活性物质最佳工艺参数，最 佳大孔吸附树脂型号为 NKA-II，吸附量为树脂质量与被吸附液体积比 5:100，吸附 流速 2BV/h，解吸附溶剂为 15%乙醇，解吸附体积为 6BV，解吸附流速为 1BV/h；经 活性比较，解吸附液活性明显大于万古霉素与去甲万古霉素。 4.首次发现菌株 1012-4 所产化合物 M 具有抗 MRSA 作用，经活性比较，其抑菌 活性显著强于万古霉素与去甲万古霉素；总结出活性化合物 M 的分离纯化工艺，采 用高效液相色谱法，色谱条件为：Boston Crest ODS 色谱柱（250 mm×21.2mm，5 μm）， 流动相：甲醇-水，梯度洗脱，流速 8mL/min，检测波长 208nm，经多次纯化，可将 化合物 M 纯度提高至 98%以上。 5.进行了化合物 M 的初步稳定性考察，结果显示对温度具有较好的稳定性， pH4.0～9.0 之间具有良好的稳定性，对胃蛋白酶敏感，对胰蛋白酶不敏感；化合物 M 的急性毒性试验提示，化合物 M 具有较好的安全性，在高达 400mg/kg 剂量下，试验 小鼠均无异常。 6.建立了高效液相色谱法测定发酵液中化合物 M 含量的方法，色谱条件为 Boston Crest ODS 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），检测波长 208nm，流动相甲醇-水（3:97）， 流速 1mL/min。结果显示化合物 M 在 1.0μg～8.0μg 范围内线性关系良好，回归方程 为 Y=908582X+345052，（r=0.9998）。该方法简便、可靠，适于发酵液中化合物 M 的 I 重庆 重庆理工大学硕士学位论文 含量测定。 关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；分离纯化；稳定性；安全 性评价；含量测定 II Abs Abstract PAGE PAGE VI Abstract Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA） is a kind of hospital infection caused by multi-resistant bacteria, with strong toxicity, resistance, and easy to spread widely, etc. MRSA infection has been recognized as one of the most difficult infectious diseases in the world. At present,there are still few effective therapeutic drugs available in clinical practice.Screening of candidate compounds for antagonising MRSA is important to develop the drug treatment of MRSA infection. This study is based on finding strains that can inhibit MRSA significantly. Active ph