克螟稻cry1ab基因lamp检测方法分析-analysis of lamp detection method for cry 1 ab gene of rice borer.docxVIP

项目基金支持本论文受浙江省自然科学基金（Y3090617），浙江省重点科技创新团队（2010R50028）与浙江省科技成果转化项目（2011E61018）资助完成。致谢本论文是在导师张明洲教授的悉心指导下完成的。值此论文完稿之际，谨向张老师致以万分感谢和崇高敬意，感谢张明洲老师在我研究生学习阶段对我学习、生活上所给予的无限关怀和谆谆教导，并祝愿老师身体健康、心想事成。张老师渊博的学识、过人的胆识、严谨的态度和创新的精神一直是我追求的目标。求学期间，张老师不仅为我创造了优越的科研和学习条件，在专业知识方面给予了悉心的指导，同时在意志品质、思想修养和人生态度方面的循循善诱、谆谆教诲也令我终身难忘，这些都将是我以后人生中的一笔宝贵财富，鼓舞我在人生道路上勇往前行。另外，还要感谢王雪艳老师和王唯芬老师，让我对分子生物学和仪器分析有更深入的认识，学到了很多技巧。同时，也要感谢方结红师兄，在论文撰写和实验思路上都给了我很大的帮助。谢谢龚云飞师兄、刘旭、李沐洁和奚茜师姐们在学习和生活中给我的关心帮助，还有学院里的老师和同学给我的帮助，是你们的支持让我三年的生活很充实，一并致以诚挚的谢意和衷心的祝福。感谢我最亲爱的家人，是你们的支持让我勇往直前！最后，衷心地感谢为评阅本论文而付出宝贵时间的专家们，谢谢大家！李庆超2013年6月克螟稻cry1Ab基因LAMP检测方法研究摘要：近年来，许多转基因生物进入到中国市场，转基因生物对生态以及人类健康带来了潜在的危害。许多国家采取相应的措施加强对转基因生物和转基因食品的监管和标识，针对转基因成分的快速、灵敏检测也越来越重要、迫切。本论文以建立快速检测cry1Ab基因的LAMP方法为主要研究目的，为快速检测转基因植物以及转基因食品提供技术支持。环介导等温扩增(LAMP)检测作为一种新的核酸扩增法，具有反应温度恒定、特异性高和反应快速等特性。本研究以克螟稻中cry1Ab基因为模板设计LAMP特异性引物，同样区域设计常规PCR和荧光定量PCR引物用于构建作为阳性对照的重组质粒与比对实验。对建立的LAMP反应体系进行条件优化，确定其反应体系为：0.2mmol/L内引物（FIPBIP），0.8mmol/L外引物（F3B3），1.4mmol/LdNTPs，0.6MBetaine，8mmol/LMgSO4，10mmol/LKCl，20mmol/LTris-HCl，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1%TritonX-100，8UBstDNAPolymerase，1μLDNA模板，双蒸水补足25μL总体积。在65℃保温60min。实验结果可通过以下三种方式鉴定：直接肉眼观察白色沉淀或浑浊度变化；添加SYBRGreenI荧光染料1μL，在紫外线照射下观察是否发出绿色荧光；琼脂糖凝胶电泳分析反应产物有无梯形条带。对设计的cry1Ab基因的LAMP引物做了特异性和灵敏度试验。实验结果显示，克螟稻品种检测呈阳性，而所有非转基因样品和其他转基因样品均为阴性，结果与常规PCR和荧光定量PCR法一致，说明LAMP引物特异性良好；以梯度稀释阳性对照重组质粒DNA为模板，LAMP检测法的灵敏度为3×102拷贝数，与荧光定量PCR法相同，高于常规PCR的灵敏度（3×105拷贝数）。植物基因组DNA快速提取方法的比较试验结果显示，TritonX-100法提取植物基因组DNA条带完整性更好，最接近试剂盒法提取的效果；并且TritonX-100法提取基因组DNA相对操作简单，适合于现场快速检测用基因组DNA的快速提取。在实际样品检测中，LAMP快速检测方法能检测出转基因成分为0.25%的混合的基因组DNA样品，能从克螟稻不同组织中检测出cry1Ab基因，结果与荧光定量PCR法一致。通过在LAMP反应体系中添加金属荧光指示剂钙黄绿素（calcein）和氯化锰，建立了克螟稻cry1Ab基因的可视化LAMP快速检测方法。其中，最优化的金属荧光指示剂的终浓度为：10μMcalcein，0.5mMMnCl2。反应结果可以通过直接观察反应液的颜色变化来判断。可视化LAMP检测cry1Ab基因的特异性和灵敏度试验结果表明，克螟稻品种检测的特异性良好；灵敏度为3×103拷贝数的阳性对照重组质粒DNA。研制了克螟稻cry1Ab基因的可视化LAMP快速检测试剂盒，保质期在4个月以上。在实际样品检测中，克螟稻cry1Ab基因的可视化LAMP快速检测方法能检测出转基因成分为0.5%的基因组DNA样品，并对4种转基因种粉末样品中cry1Ab基因进行检测。结果表明：BT11玉米粉中检测出约2.5%的cry1Ab基因成分，GT73油菜籽粉不含有cry1Ab基因成分，MON810玉米粉检测出1-2.5%的cry1Ab基因成分，BT176玉米粉检测出约1%的cry1Ab基因