蓝圆鲹蛋白制备抗氧化肽的分析-analysis on preparation of antioxidant peptides from decapterus maruadsi protein.docxVIP

蓝圆鲹蛋白制备抗氧化肽的研究摘 要蓝圆鲹（Decapterus maruadsi）属于鲈形目鲹科圆鲹属的一种，是我国 重要的经济鱼类之一。对其加工利用制成鱼糜罐头制品或改性制备功能活 性肽，则可大大提高其附加值。本文以蓝圆鲹蛋白为原料，运用酶解技术 制备抗氧化肽，采用体外评价法测定其抗氧化活性，通过多种分离技术手 段对蓝圆鲹多肽进行分级分离，并采用基质辅助激光解析电离飞行时间串 联质谱对目标肽段进行一级氨基酸序列鉴定。新发现的肽段经化学合成后， 对其进行体外抗氧化活性验证及反应动力学研究。最后研究了蓝圆鲹多肽 在加工储藏过程中，及体外模拟胃肠消化道过程中的抗氧化活性稳定性， 并探讨了蓝圆鲹多肽与其他常见抗氧化剂的协同抗氧化效应。主要研究结 果如下：（1）通过凯氏定氮法、索氏抽提法和OPA柱前衍生化高效液相色谱法 分别测定蓝圆鲹蛋白的基本组分含量 。结果表明蓝圆鲹是一种高蛋白（80.16%）、低脂肪（10.38%）、必需氨基酸含量（46.28 g/100 g protein）和 抗氧化性氨基酸含量（32.59 g/100 g protein）均较理想的食品原料。在此基2础上运用蛋白酶解技术，以DPPH·清除活性、O ?·清除活性及还原能力三种体外抗氧化能力为评价指标，分别采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶五种商业蛋白酶水解蓝圆鲹蛋白。综合比较后 选择碱性蛋白酶作为制备蓝圆鲹蛋白抗氧化肽的最佳蛋白酶。（2）以水解度为指标，分别采用单因素法和Box-Benhnken Design (BBD)响应面法优化碱性蛋白酶水解蓝圆鲹蛋白的酶解工艺条件，建立了水解度1（Y）与初始底物浓度（S0，X1）、初始酶浓度（E0，X2）、pH（X3）、酶解温 度（T，X4）4个因素之间的二元回归模型：Y=22.23-1.05X1+0.66X2+0.79X3+ 1.09X4-0.082X1X2+0.11X1X3+0.16X1X4-0.17X2X3-0.067X2X4-0.25X3X4-0.04X 2222-0.22X2 -0.37X3 -0.44X4 。并根据此数学模型进行参数最优化分析计算得到最佳酶解条件：初始底物浓度16.3 g·L?1，初始酶浓度0.11 g·L?1，酶解温度 50.5 °C，pH 8.18，水解300 min，理论上可达到22.2%的水解度值，与模型 验证实验值22.4%接近。同时，实验研究发现蓝圆鲹蛋白水解产物的抗氧化 活性、氨基酸组成及分子量分布均与水解度密切相关。水解度为23.0%的酶 解产物的抗氧化活性较高，与其产物中的抗氧化性氨基酸含量相对应。（3）碱性蛋白酶在45.0 °C至65.0 °C范围内的酶失活热动力学性质研究 表明，碱性蛋白酶失活符合蛋白酶一级热失活动力学方程。在50.0 °C、pH 9.5 的反应条件下，碱性蛋白酶酶解蓝圆鲹蛋白的米氏常数Km值为29.115 g·L?1。 并建立了碱性蛋白酶可控酶解蓝圆鲹 蛋白的水解度动力学模型为 ：????EDH ??5.970 ??ln ?1????34.869 ?0 ??0.045????t ?，水解速率动力学模型为： ??S0??E??r ???208.1758 0 ??0.2723 exp ??0.1675??DH ???，实验验证表明在一定程度上模型?????S0?数据与实验结果吻合良好。（4）采用超滤、凝胶层析、高效液相色谱等不同分离纯化技术对蓝圆 鲹蛋白酶解产物进行分离纯化，得到抗氧化活性较好的两个高亲水性肽片 段B11和B12。采用MALDI-TOF-TOF MS分析鉴定其氨基酸序列结构，得到B11、B12抗氧化肽氨基酸序列分别为His-Asp-His-Pro-Val-Cys（HDHPVC，Da）和His-Glu-Lys-Val-Cys（HEKVC，615.22 Da）。B11、B12经化2学合成后，分别采用DPPH·清除法、O ?·清除法及还原能力法三种体外抗氧化活性检测法验证其抗氧化能力。结果表明两个抗氧化肽均具有较强的抗氧化能力。（5）对抗氧化肽HDHPVC和HEKVC清除DPPH·反应进行了动力学研 究。结果表明HDHPVC和HEKVC均属于慢反应动力学性质，其在固定30 min 反应时间条件下的EC50值（分别为31.0 μM和67.7 μM）比稳态条件下的IC50 值（分别为9.0 μM和14.5 μM）偏大3至5倍。HDHPVC和HEKVC的二级反 应速率常数k2分别为2.00×10?5 μM?1·s?1和0.70×10?5 μM?1·s?1，表明HEKVC清 除能力较差，而 HDHPVC 清除能力稍逊于对照物 GSH （ k2 为 2.30×10?5 μM?1·s?1）。（6）热稳定性实验结果