酪氨酸酶天然源抑制剂的分析报告-analysis report of tyrosinase inhibitors from natural sources.docxVIP

摘要本论文包括五个部分：第一部分：酪氨酸酶抑制剂研究综述从酪氨酸酶抑制剂的结构、性质、作用机理、构效关系和资源等方面概述了目前酪氨酸酶抑制剂的研究现状，探讨今后该领域的研究重点和发展方向。第二部分：酪氨酸酶的提取与初步纯化及其性质的研究因为进口酪氨酸酶和常用底物多巴价格昂贵，且多巴又易为空气氧化，为了建立一个经济、方便、有效的体外酪氨酸酶抑制剂筛选模型，采用缓冲液提取、硫酸铵盐溶盐析、透析及反渗透等方法从双孢菇中提取并部分纯化了酪氨酸酶，并以L-酪氨酸为底物，开创性地选择在波长317nm，而不是传统上的475nm处比色，以测定酶活。结果表明：丙酮沉淀,硫酸铵盐溶盐析的纯化方法可使酪氨酸酶的比活力提高501.2倍;于波长317nm处比色测酪氨酸酶活性，在0-10min内呈良好线性关系，灵敏度远较传统法高，而重复性问题，只要细心选择适当的反应速度，亦可满意地解决。动力学研究测得该酶的Km=0.543mmol/L，Vmax=41.5U/min。最适pH为6.5，在pH5-7之间，酶的活力最高；最适反应温度为30℃，在20-40℃范围内保持较高的活性。第三部分：菠萝中酪氨酸酶抑制因子的提取、分离与初步纯化菠萝汁中组分复杂，活性成分含量甚微，特别是其中大多为水溶性成分，相关分离与纯化手段较少。实验中将菠萝切片并真空干燥（得率6.18％），干物质甲醇提取（得率77.9%）,再将提取物浓缩至干后经石油醚、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇梯度提取得率依次为0.10、0.11、0.24、0.68、0.69和6.35%。酶反应动力学试验跟踪显示菠萝中抑制酪氨酸酶的活性成分存在于乙醇组分，定性试验结果表明，活性成分的分子具有糖苷的结构特征，而无酚羟基存在。当浓度为0.005g/mL时，抑制率35.1%;经过柱层析纯化后当浓度为0.001g/mL时抑制率升至54.1%，且为不可逆抑制机制。第四部分：菠萝源抑制剂对双孢菇汁抗褐变实验将酶动力学筛选得到的天然酪氨酸酶抑制成分应用于双孢菇浆的抗褐变，以考察本课题中所建立的酪氨酸酶动力学体外筛选模型在实际应用中的有效性。结果表明：菠萝汁、乙醇粗提物、柱层析纯化后的组分H4，在浓度分别为5.00、3.55和0.39﹪时对双孢菇浆的褐变均有一定程度的抑制作用，其抑制率分别为54.8、65.1和87.1﹪，按抵制率大小依次为：H4﹥乙醇粗提物﹥菠萝汁。说明菠萝汁中的确含有可以抑制某些食品褐变的功能成分，也进一步证实这一体外筛选模型是可行的。第五部分：菠萝中酪氨酸酶抑制因子的纯化及其性质的研究菠萝中的活性成分经过硅胶柱层析后的色谱纯组分H4再经sephedexLH20凝胶层析后，液相分析显示纯度为99.9%。酶反应体系中浓度4μg/mL时，酶活被安全抑制。核磁、电喷离电离质谱分析结果显示活性成分可能是分子量为442的糖苷，其糖部分为果二糖，苷元为甲氧基呋喃。关键词：褐变酪氨酸酶抑制剂菠萝ABSTRACTThisthesisconsistsoffiveparts:Thefirstpart:studyoftyrosinaseinhibitorsThecurrentresearchontyrosinaseinhibitorswasreviewedfromfiveaspects,structure,character,workingmechanism,resourceandtherelationsbetweenstructureandactivitytodiscussthefocusandthetrendofdevelopmentinthisfieldandtobroadentheideastofindoutsomenewhypoglycemicfunctionalfactors.Thesecondpart:extractionandpurificationoftyrosinaseTyrosinseandDOPAbuyedfromabroadcompanyisexpensive,andDOPAiseasytobeoxidedbytheair.Torearchaneconomic,convenientandvalidinvitrotyrosinaseinhibitorscreeningmodel,tyrosiansefromtheAgaricusbisporusareextractedandpurifiedbybufferextraction,(NH4)2S04precipitationusingL-tyrosineassubstratebythewayofultravioletspectrophotometryat317nmbutnottraditional475nm.Theresultshows:Thesensi