罹病茎瘤芥腈水解酶基因克隆及动态表达rtqpcr分析-cloning and dynamic expression of nitrilase gene in tumorous stem mustard rtqpcr analysis.docxVIP

摘要茎瘤芥（榨菜）是我国的特色作物，涪陵榨菜是涪陵区产业中的优势、支柱 产业，在农村经济中具有重要地位，但是近年来，重庆涪陵及国内其他地区的榨 菜产量受到根肿病的严重影响，造成一定的经济损失。十字花科根肿病是一种土 传病害，主要侵染十字花科作物，而且土壤一旦受到根肿菌的感染，带菌时间较 长，不再适宜十字花科作物的种植。化学防治在一定程度上可以防治根肿病，但 不能彻底根治，所以为了彻底控制根肿病的发生，当务之急是了解根肿病的致病 机理。根肿病的典型特征是根部肿瘤的形成，主要是生长素和细胞分裂素的过度 合成，腈水解酶是合成生长素途径中的关键酶，将吲哚-3-乙腈（IAN）转化为吲 哚乙酸（IAA），近年来成为研究的热点。本研究采用人工接种根肿菌接种体的方 法，以茎瘤芥健根和病根为实验材料，采用Real-time PCR技术，用稳定表达的管 家基因作为内参基因，分析腈水解酶基因的动态表达情况，探索腈水解酶与根肿 病发病的关系，以期为研究根肿病的致病机理提供依据。为了获得各期根肿病发病材料，采用珍珠岩加MS培养液建立了无土快繁人工 种植体系，为大量培养茎瘤芥幼苗用于致病性测试提供了均一化接种材料。当茎 瘤芥生长至四片真叶时，处理组每钵人工接种500毫升（108个孢子/mL）根肿菌接 种体，对照组加入等量的灭菌水，分别在处理后10，15，20，25，30和40 天时， 收获茎瘤芥的根，为本研究的实验材料。设计筛选内参基因和腈水解酶基因引物，优化退火温度，并制作标准曲线， 通过获得扩增效率和相关系数值进一步验证引物。定期收获茎瘤芥的根，提取总 RNA，进行DNase酶处理，RNA纯化，合成cDNA一链，以此为模板用筛选得到的 引物对，采用荧光定量PCR技术对内参基因和腈水解酶基因进行扩增。经geNorm 和NormFinder软件分析内参基因的稳定性，筛选稳定表达的内参基因，用于腈水 解酶基因的表达量矫正。geNorm软件分析结果表明：ACT 和UBE在处理组和对照组共12个样品中，表 达最稳定， 其次是RPL2，NADH 表达变化最大；而NormFinder软件分析结果表 明3个最稳定的内参依次为RPL2、ACT、UBE，综合上述结果，确定了以ACT、UBE 和RPL2为内参基因，将腈水解酶表达数据用IQ5软件分析，分析结果表明，BjNIT1 在接种根肿菌接种体后20天的病株根部，表达量开始增加，而在健株中到40天为 止BjNIT1的表达量均处在较低水平；在40天时BjNIT1在病株中的表达量大约是在健 株中表达量的50倍。在接种后10-30天间，BjNIT2在病株根部的表达量均低于健株， 在20天时，差异达到最大；在40天时，两组中的BjNIT2的表达量几乎相等。从接种后至30天为止，BjNIT4在病株根部的表达量没有大的变化，而在40天时BjNIT4在病根中的表达量加倍。 用RACE技术扩增腈水解酶基因cDNA全长，利用SMART，Expasy等在线软件分析推导的氨基酸序列的基本性质和蛋白质结构，并利用Clustalx软件构建进化树。结果表明所测得的745bp 的BjNIT1序列包括390bp开放阅读框，79bp的 5 非翻译 区和276bp的 3 非翻译区；696的BjNIT2序列包括390bp的开放阅读框，63bp的 5非翻译区和243bp的 3 非翻译区；1026的BjNIT4序列包括825bp的开放阅读框， 21bp 的5 非翻译区和180bp 的3 非翻译区。三个测得的腈水解酶序列均有加尾信 号AATAAA和poly(A)尾巴。蛋白质功能位点和功能结构域分析表明，扩增的cDNA 序列的5 端不完整。系统进化树显示茎瘤芥腈水解酶与同属植物芜菁的亲缘关系 较近，其次是大白菜。本研究的结果显示，内参基因ACT、UBE 和 RPL2在茎瘤芥根中表达情况较 为稳定，腈水解酶动态分析显示，BjNIT1的表达量受到根肿菌的诱导，以期为茎 瘤芥根肿病致病机理的研究提供数据依据。关键词：茎瘤芥，根肿菌，腈水解酶，内参基因，RT-qPCRABSTRACTBrassica juncea var. tumida Tsen, is a special crop in China, Fuling pickle is the largest production scale, the most powerful radiation drive traditional pillar industries and competitive industries in Fuling District rural economy. But in recent years, the production of mustard in Fuling District